[논문]참느릅나무에서 추출된 catechin 유도체 화합물의 멜라닌 생성 억제 효과

황태혁; 이효정; 강동민; 문경미; 유재철; 안미정; 문동규; 우동균

doi:10.5352/jls.2023.33.2.169

초록
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자외선으로 야기되는 피부조직의 손상에 대한 방어기전으로 멜라닌세포는 멜라닌 색소를 생산한다. 이러한 멜라닌 생성에는 tyrosinase 효소가 중추적인 역할을 수행한다. 그러나 과다한 멜라닌 생성은 피부조직에 주근깨와 검버섯 등의 과다 색소침착 병변을 일으킨다. 따라서 tyrosinase 발현이나 활성을 조절함으로써, 과도한 멜라닌 생성을 억제하는 물질을 발굴하는 것은 임상적인 의미가 있다. Catechin은 tyrosinase 발현을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제하는 화합물로 알려져 있다. 본 연구에서는 B16F10 마우스 흑색종 세포주와 버섯에서 추출된 tyrosinase를 사용하여, 참느릅나무의 줄기 껍질에서 추출 및 동정된 catechin 유도체 화합물(C5A, C7A, C7G, 및 C7X)의 멜라닌 생성 억제 효능을 검증하였다. 먼저, B16F10 세포주에서, 세포독성을 나타내지 않는 농도의 catechin 유도체 화합물 처리는, 모두α-MSH로 촉진된 멜라닌 생합성을 억제하는 효능을 보였다. Catechin 유도체 화합물의 이러한 효능은 멜라닌 생합성 저해제로 잘 알려진 kojic acid와 비슷한 수준이였다. 또한, C5A와 C7A는 버섯에서 추출된 tyrosinase의 효소 활성을 통계적으로 유의하게 억제하였다. 또한, 컴퓨터 분석을 통해 C5A와 C7A는 kojic acid와 유사한 수준으로 tyrosinase의 active site에 결합할 것으로 예측되었다. 이에 더하여, 4종류의 catechin 유도체 화합물 모두가 α-MSH 처리된 B16F10 세포주에서 tyrosinase 단백질 발현을 감소시켰다. 본 연구결과를 종합하면, 참느릅나무에서 추출/동정된 catechin 유도체 화합물은 멜라닌세포의 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하였다. 따라서, 본 연구결과는 이러한 catechin 유도체 화합물이 피부의 과다 색소침착 질환 제어를 위한 새로운 조절 물질로 응용될 수 있음을 제시한다.

Abstract ▼ AI-Helper

As a protective defensive mechanism against ultraviolet (UV) light exposure in skin tissue, melanocytes produce the pigment melanin. Tyrosinase plays a key role in melanin production in melanocytes. However, the overproduction of melanin can lead to lesions, such as freckles and dark spots. Thus, it...

As a protective defensive mechanism against ultraviolet (UV) light exposure in skin tissue, melanocytes produce the pigment melanin. Tyrosinase plays a key role in melanin production in melanocytes. However, the overproduction of melanin can lead to lesions, such as freckles and dark spots. Thus, it is clinically important to find a modulating molecule to control melanogenesis by regulating tyrosinase expression and/or activity. It is known that catechin, a plant flavonoid, can reduce melano- genesis through the downregulation of tyrosinase expression. Here, we tested whether catechin derivatives isolated from the stem bark of Ulmus parvifolia have an effect on melanin production by regulating tyrosinase in mouse melanoma cells and in vitro mushroom tyrosinase. The catechin derivatives used in this study included C5A, C7A, C7G, and C7X. Treatments using these catechin derivatives reduced melanin production in mouse melanoma B16F10 cells in which melanogenesis was stimulated by α-MSH. Notably, the anti-melanogenic effects of catechin derivatives were similar to those of kojic acid, a well-known anti-melanogenic molecule. Both C5A and C7A directly inhibited the activity of tyrosinase isolated from mushrooms in vitro. Furthermore, our in silico computational simulation showed that these two compounds were expected to bind to the active site of tyrosinase, which is similar to kojic acid. In addition, all four catechin derivatives reduced tyrosinase protein expression. In summary, our results showed that catechin derivatives can reduce melanogenesis by regulating tyrosinase activity or expression. Thus, this study suggests that catechin derivatives isolated from U. parvifolia can be novel modulators of melanin production.

Keyword

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Chemical structures of catechin derivatives used in this study. The chemical structure of catechin is shown. In the bottom margin, substituents for R1 and R2 sites in C5A, C7A, C7G, and C7X are described respectively.
그림 Fig. 2. Effects of catechin derivatives on the viability of B16F10 cells. Cell viabilities of catechin, C5A, C7A, C7G, and C7X-treated B16F10 cell cultures were assessed by MTT assay.
그림 Fig. 3. Melanin contents of B16F10 cells stimulated with α-MSH. B16F10 cells were pretreated with C5A, C7A, C7G, C7X, or kojic acid for 1 hr and then the cells were stimulated with α-MSH for 72 hr. The cellular melanin contents are expressed as the relative percentage of the untreated control. ^***p< 0.001, and ^###p<0.0001.
그림 Fig. 4. Effects of catechin derivatives on tyrosinase activity and expression. (A) In vitro mushroom tyrosinase activities were measured in a reaction using tyrosine substrate and C5A, C7A, C7G, and C7X. Kojic acid was used as a positive control for tyrosinase inhibition. ^*p<0.05, ^**p<0.01, and ^***p<0.001. (B) A representive image of Western blotting analysis for tyrosinase protein expression in B16F10 cells treated with C5A, C7A, C7G, and C7X.
그림 Fig. 5. In silico docking simulation and pharmacophore analysis between tyrosinase and C5A/C7A. Protein-ligand docking sitimulation and pharmacophore analysis were performed using AutoDock 4.2 and Ligand Scout 3.1 software respectively. (A) Docking simulation between the active site of tyrosinase and kojic acid. (B) Docking simulation between the active site of tyrosinase and C5A. (C) Docking simulation between the active site of tyrosinase and C7A. (D) A table shows binding energy values from our computational analysis.

AI 본문요약
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제안 방법

따라서, 이하 본 연구의 catechin 유도체 화합물을 이용한 세포실험에서, 세포독성을 충분히 배제할 수 있도록 20 μM 이하의 농도를 사용하였다.
멜라닌 생성기전 연구에 흔히 사용되는 mouse melanoma 세포주인 B16F10 세포에 catechin 유도체 화합물(C5A, C7A, C7G, 및 C7X)를 10, 20, 및 50 μM 농도로 72시간 동안 처리하고, 약물 처리를 하지 않은 대조군과 비교하여 나타난 세포독성을 분석하였다
Catechin 유도체 화합물이 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해, mushroom tyrosinase (500 units)가 촉매하는 in vitro 화학반응에 50 μM 농도로 C5A, C7A, C7G, 및 C7X를 각각 처리하였다
Catechin 유도체 화합물이 B16F10 세포주에서 tyrosinase 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 세포독성이 없는 20 μM 농도로 C5A, C7A, C7G, 및 C7X를 각각 전처리(24시간) 하였고, 이후에 α-MSH (1 μM, 48시간)로 자극하였다.
본 논문에서는 이들 catechin 유도체 화합물을, catechin-5-O-β-D-apiofuranoside는 C5A로, catechin-7-O-β-D-apiofuranoside는 C7A로, catechin-7-O-β-D-glucopyranoside는 C7G로, 및 catechin-7-O-β-D-xylopyranoside는 C7X로 각각 축약하여 명명하였다
B16F10 세포주에서 멜라닌 생성에 대한 catechin 유도체 화합물 (C5A, C7A, C7G, 및 C7X)의 영향을 알아보기 위하여, catechin 유도체 화합물을 5, 10, 20 μM 농도로 각각 전처리한 후에, α-MSH 호르몬을 처리하여 멜라닌 생성을 유도하였다

대상 데이터

2 software를 이용한 docking simulation 분석을 실행하였다. 컴퓨터분석에 사용된 mushroom tyrosinase의 구조는 Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X)로부터 획득하였다. Protein-ligand 결합을 이루는 아미노산 잔기를 예측하기 위하여, Ligand Scout 3.
본 연구에 사용된, 참느릅나무로부터 추출/동정된 flavonoids 계열의 catechin 유도체 화합물은 flavan-3-ol backbone의 5 또는 7번째 탄소에 각기 다른 당 치환기를 갖는다(Fig. 1).

데이터처리

모든 실험은 최소한 3회 이상의 독립적인 반복을 실시하였고, 반복실험에서 얻은 결과는 Graphpad Prism 7 software (GraphPad, La Jolla, USA)를 이용하여 Student’s two-tailed t-test를 수행하였고, 데이터 결과값은 평균±표준편차로 나타내었다
Tyrosinase의 active site와 C5A (또는 C7A) 사이의 protein-ligand 결합을 예측하기 위하여, AutoDock 4.2 software를 이용한 docking simulation 분석을 실행하였다. 컴퓨터분석에 사용된 mushroom tyrosinase의 구조는 Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X)로부터 획득하였다.
컴퓨터분석에 사용된 mushroom tyrosinase의 구조는 Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X)로부터 획득하였다. Protein-ligand 결합을 이루는 아미노산 잔기를 예측하기 위하여, Ligand Scout 3.1 software를 사용한 pharmacophore 분석을 실행하였다. In silico 분석에서, 기존의 알려진 tyrosinase 저해제인 kojic acid를 positive control로 사용하였다.
이러한 결과에서, 이들 catechin 유도체 화합물이 직접 tyrosinase와 결합하여 그 활성을 억제할것이 의심된다. 이러한 가설을 증명하기 위해, AutoDock 4.2 software를 사용하여, tyrosinase의 활성자리(active site)와 C5A (또는 C7A)사이의 결합을 예상할 수 있는 in silico docking simulation 분석을 실행하였다. Tyrosinase의 active site에 C5A (또는 C7A)를 컴퓨터 분석으로 결합시켰을 때, 잘 알려진 tyrosinase 저해제인 kojic acid와 유사한 수준의 binding energy values를 보이며 결합이 예측되었다(Fig.

이론/모형

본 논문에서는 이들 catechin 유도체 화합물을, catechin-5-O-β-D-apiofuranoside는 C5A로, catechin-7-O-β-D-apiofuranoside는 C7A로, catechin-7-O-β-D-glucopyranoside는 C7G로, 및 catechin-7-O-β-D-xylopyranoside는 C7X로 각각 축약하여 명명하였다. 먼저 catechin 유도체 화합물이 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay 기법으로 세포독성 분석을 수행하였다. 멜라닌 생성기전 연구에 흔히 사용되는 mouse melanoma 세포주인 B16F10 세포에 catechin 유도체 화합물(C5A, C7A, C7G, 및 C7X)를 10, 20, 및 50 μM 농도로 72시간 동안 처리하고, 약물 처리를 하지 않은 대조군과 비교하여 나타난 세포독성을 분석하였다.

성능/효과

3에서 보여지듯, 대조군에 비해 α-MSH 호르몬 처리는 B16F10 세포의 멜라닌 생성을 약 60% 증가시켰다
2에서 보여지듯 각각의 catechin 유도체 화합물은 B16F10 세포주에서 50 μM 농도 처리까지는 통계적으로 유의한 세포독성을 유발하지 않았다
또한 잘 알려진 멜라닌 생성 억제 물질인 kojic acid 처리(20 μM)는 α-MSH 호르몬의 자극으로 유도된 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하였다
특히, C5A, C7G, 및 C7X는 20 μM 처리 농도에서 멜라닌 생성 억제 효과가 kojic acid 보다 큰 것으로 나타났다
흥미롭게도, 본 연구에 사용된 4 종류의 catechin 유도체 화합물 모두 α-MSH-유도 멜라닌 생성을 억제하였다
특히, C5A, C7G, 및 C7X는 20 μM 처리 농도에서 멜라닌 생성 억제 효과가 kojic acid 보다 큰 것으로 나타났다. 또한, catechin에 비하여, 4종류의 catechin 유도체 화합물 모두가 멜라닌 생성 억제 효능이 더 높은 경향을 보였다.
본 연구에 사용된 catechin 유도체 화합물(C5A, C7A, C7G, 및 C7X) 모두가 α-MSH로 유도된 tyrosinase 단백질 발현 증가를 감소시겼다.
Fig. 4A에서 보여지듯, 잘 알려진 tyrosinae 저해제인 kojic acid는 mushroom tyrosinase 촉매반응을 약 50% 억제하였다. 또한, 이미 보고된 바와 같이 catechin은 직접적인 tyrosinase 활성 억제 효과는 나타내지 않았다.
4A에서 보여지듯, 잘 알려진 tyrosinae 저해제인 kojic acid는 mushroom tyrosinase 촉매반응을 약 50% 억제하였다. 또한, 이미 보고된 바와 같이 catechin은 직접적인 tyrosinase 활성 억제 효과는 나타내지 않았다. 본 연구에 사용된 catechin 유도체 화합물 중에서 C5A와 C7A는 tyrosinase 활성 억제 효과를 보인 반면에, C7G와 C7X는 억제 효과가 없었다.
또한, 이미 보고된 바와 같이 catechin은 직접적인 tyrosinase 활성 억제 효과는 나타내지 않았다. 본 연구에 사용된 catechin 유도체 화합물 중에서 C5A와 C7A는 tyrosinase 활성 억제 효과를 보인 반면에, C7G와 C7X는 억제 효과가 없었다.
본 연구결과에서 catechin 유도체 화합물 중 C5A와 C7A는 mushroom tyrosinase의 효소활성을 저해하는 것으로 나타났다(Fig. 4A).
4A). 이러한 결과에서, 이들 catechin 유도체 화합물이 직접 tyrosinase와 결합하여 그 활성을 억제할것이 의심된다. 이러한 가설을 증명하기 위해, AutoDock 4.

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