[논문]육계 사료 내 삼채뿌리분말 첨가가 장내 미생물 및 장관면역에 미치는 영향

지운학; 조인호; 주상석; 정문경; 이채원; 윤준혁; 안수현; 김명후; 공창수

doi:10.5536/kjps.2023.50.3.171

육계 사료 내 삼채뿌리분말 첨가가 장내 미생물 및 장관면역에 미치는 영향
Gut Microbiome and Gut Immunity in Broiler Chickens Fed Allium hookeri Root Powder from Day 10 to 28 원문보기

한국가금학회지 = Korean journal of poultry science, v.50 no.3, 2023년, pp.171 - 185

지운학 (부산대학교 동물생명자원과학과) , 조인호 (경북대학교 축산BT학과) , 주상석 (부산대학교 동물생명자원과학과) , 정문경 (부산대학교 동물생명자원과학과) , 이채원 (경북대학교 축산BT학과) , 윤준혁 (경북대학교 축산BT학과) , 안수현 (경북대학교 축산BT학과) , 김명후 (부산대학교 동물생명자원과학과) , 공창수 (경북대학교 축산학과)

초록
AI-Helper

본 연구는 부화 후 10일부터 28일까지 사료내 삼채뿌리분말 첨가가 장내 미생물 균총, 장관면역, 및 장건강에 미치는 영향을 평가하고자 수행하였다. 10일령 Ross 308 육계 총 60수를 공시하여 체중을 측정한 후 난괴법을 이용하여 6반복으로 2처리구에 할당하였다. 실험사료는 옥수수-대두박 기반의 대조사료와 대조사료에서 옥수수 0.3% 대신 삼채뿌리분말 0.3%를 첨가한 처리사료로 구성하였고, 18일간 사료와 물을 무제한 급이하였다. 부화 후 28일째에 각 케이지마다 체중 중앙값에 근접한 2수를 선발하여 맹장내 분변 및 장관조직 샘플을 수집하였다. 사료내 삼채뿌리분말 첨가가 Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Limosilactobacillus, Cuneatibacter 및 Ruminococcoides와 같은 생균제 후보 미생물을 증가시킴을 확인하였다. 장관면역의 경우, 삼채뿌리분말 첨가가 helper T cell의 한 종류인 CD3+CD4+ T cell의 유의미한 감소(P=0.049)를 야기하였다. 또한 삼채뿌리분말 첨가가 사이토카인 및 항산화기능 관련 유전자 발현 분석에서 IL1b, IL6, 및 IL10과 같은 사이토카인에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았으나 항산화기능 관련 유전자 GPX2 발현이 증가하는 경향이 확인되었다 (P=0.060). 따라서 본 연구의 결과를 종합해보면, 삼채뿌리분말을 첨가한 육계사료를 부화 후 10일부터 28일까지 급이 시 육계 장내미생물에 긍정적인 영향을 주고, 장건강을 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was conducted to investigate the effects of supplementation of Allium hookeri (AH) root powder on the gut microbiome, immunity, and health in broiler chickens fed experimental diets from d 10 to 28. A total of 60 10-day-old Ross 308 broilers were weighed and assigned to two dietary treatments with 5 birds per cage in a randomized complete block design based on body weight. The two experimental diets consisted of a control diet based on corn-soybean meal and the control diet supplemented with 0.3% AH root powder. All birds were fed ad libitum with experimental diets and water for 18 d. At 28 d, two birds near the median weight from each cage were selected for cecal content and small intestinal tissue sample collection. The addition of AH changed the gut microbiome by increasing probiotic candidate beneficial bacteria such as Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Limosilactobacillus, Cuneatibacter, and Ruminoccoides. Regarding gut immunity, the supplementation of AH resulted in changes in intestinal immune cells, including reduced CD3+CD4+ T cells, which are a type of helper T cell, in the small intestine of birds (P=0.049). Additionally, there was a tendency to increase the expression of antioxidant function-related gene such as GPX2 (P=0.060), but no significant changes were observed in cytokines such as IL1b, IL6, and IL10. Overall, the addition of AH root powder may have positive effects on the microbiome of the chickens. This may help promote gut health in broiler chickens at the age of d 10 to 28.

주제어

표/그림 (9)

표 Table 1. Ingredient and nutrient composition of experimental diets (as-fed basis)
표 Table 2. Calculated energy and nutrient compositions of the experimental diets (as-fed basis)
표 Table 3. List of chicken primers used in the study
그림 Fig. 1. Effect of supplementation of AH in diet on alpha diversity. Alpha diversity measured by the diversity index was indicated by control (red) and AH (blue). The line in each box means the center value, and whiskers showed the highest and lowest values within the 1.5th quartile range (IQR). Significant differences between treatments were analyzed using the two-tailed unpaired t-test. AH, Allium hookeri.
그림 Fig. 2. Effect of supplementation of AH on the phyla (A), families (B), and genera level (C) compositions of cecal microbial communities in 28-day-old broilers. Proportions of the microbiome represented by less than 1% at the family level and less than 0.5% at the genus level were classified as "Others" category. AH, Allium hookeri
그림 Fig. 3. Linear discriminant analysis effect (LEfSe) cladogram and linear discriminant analysis (LDA) based on operational taxonomic units were used to differentiate the cecal microbial communities of birds fed experimental diets. (A) Cladogram indicating the phylogenetic distribution of the cecal microbial communities. (B) Linear discriminant analysis (LDA) score bar graph showing microbiome difference between control group and AH group. AH, Allium hookeri.
그림 Fig. 4. Changes in the populations of T cells in the small intestine of 28-day-old broilers fed a control diet or a diet containing AH. Each data point represents six replicates and is presented as means±S.D. Significant differences between treatments were analyzed by a two-tailed unpaired t-test. * Indicate significance at P<0.05. AH, Allium hookeri.
그림 Fig. 5. Changes in the populations of antigen-processing cells in the small intestine of 28-day-old broilers fed a control diet or a diet containing AH. Each data point represents six replicates and is presented as means±S.D. Significant differences between treatments were analyzed by a two-tailed unpaired t-test. AH, Allium hookeri.
그림 Fig. 6. The expression of gut immunity and gut health-related genes in small intestine tissue of birds fed diet containing AH. Each data point represents six replicates and is presented as means±S.D. Significant differences between treatments were analyzed by a two-tailed unpaired t-test. Significant differences between treatments were analyzed by a two-tailed unpaired t-test. ^# Indicate tendency at 0.05

표/그림 (9)

표 Table 1. Ingredient and nutrient composition of experimental diets (as-fed basis)

표 Table 2. Calculated energy and nutrient compositions of the experimental diets (as-fed basis)

표 Table 3. List of chicken primers used in the study

그림 Fig. 1. Effect of supplementation of AH in diet on alpha diversity. Alpha diversity measured by the diversity index was indicated by control (red) and AH (blue). The line in each box means the center value, and whiskers showed the highest and lowest values within the 1.5th quartile range (IQR). Significant differences between treatments were analyzed using the two-tailed unpaired t-test. AH, Allium hookeri.

그림 Fig. 2. Effect of supplementation of AH on the phyla (A), families (B), and genera level (C) compositions of cecal microbial communities in 28-day-old broilers. Proportions of the microbiome represented by less than 1% at the family level and less than 0.5% at the genus level were classified as "Others" category. AH, Allium hookeri

그림 Fig. 3. Linear discriminant analysis effect (LEfSe) cladogram and linear discriminant analysis (LDA) based on operational taxonomic units were used to differentiate the cecal microbial communities of birds fed experimental diets. (A) Cladogram indicating the phylogenetic distribution of the cecal microbial communities. (B) Linear discriminant analysis (LDA) score bar graph showing microbiome difference between control group and AH group. AH, Allium hookeri.

그림 Fig. 4. Changes in the populations of T cells in the small intestine of 28-day-old broilers fed a control diet or a diet containing AH. Each data point represents six replicates and is presented as means±S.D. Significant differences between treatments were analyzed by a two-tailed unpaired t-test. * Indicate significance at P<0.05. AH, Allium hookeri.

그림 Fig. 5. Changes in the populations of antigen-processing cells in the small intestine of 28-day-old broilers fed a control diet or a diet containing AH. Each data point represents six replicates and is presented as means±S.D. Significant differences between treatments were analyzed by a two-tailed unpaired t-test. AH, Allium hookeri.

그림 Fig. 6. The expression of gut immunity and gut health-related genes in small intestine tissue of birds fed diet containing AH. Each data point represents six replicates and is presented as means±S.D. Significant differences between treatments were analyzed by a two-tailed unpaired t-test. Significant differences between treatments were analyzed by a two-tailed unpaired t-test. ^# Indicate tendency at 0.05

AI 본문요약
AI-Helper

제안 방법

PCR은 다음 순서에 따라 진행되었다: (1) 95℃에서 3분, (2) 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 25 사이클 반복, (3) 72℃에서 5분. PCR 결과물은 순도를 확인하기 위해 AMPure beads(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 확인되었으며, 최종 정제된 제품의 양을 확인하기 위해 qPCR 정량화 프로토콜 가이드(KAPA Library Quantification kits for Illumina sequencing platforms)에 따라 정량화하고 TapeStation D1000 ScreenTape(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)를 사용하여 검증했다. 그후, paired-end(2 × 300 bp) sequencing은 MiSeq platform(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 Macrogen에서 실시하였다.

사료내 삼채뿌리분말 첨가가 육계의 장관 조직에서 사이토카인 및 항산화기능 관련 유전자 발현에 어떤 영향을 주는지 구명하기 위해 qRT-PCR 분석을 실시하였다. 본 연구에서 사료내 삼채뿌리분말 첨가가 육계 장관내 사이토카인 관련 유전자에 영향을 주는지 확인한 결과, 사이토카인 관련 유전자 발현에는 유의미한 차이를 관찰하지는 못하였다(Fig.

미생물 군집 데이터를 비교, 분석하기 위해 QIIME2를 사용하여 ASV의 풍부도 및 분류 정보를 사용하였다. 샘플내 미생물 군집의 다양성과 균일성을 확인하기 위해 Shannon 지수와 Simpson 지수, Chao1 지수를 통해 알파 다양성을 확인하였다. 육계 사료내 삼채뿌리분말의 첨가가 장내 미생물의조성변화에 미치는 영향을 확인하기 위해 Huttenhower Lab Galaxy Server 2.

데이터처리

육계 사료내 삼채뿌리분말의 첨가가 장내 미생물의 조성에 끼치는 영향과 장내 면역세포 및 사이토카인과 항산화기능 관련 유전자의 발현에 대한 결과의 통계분석은 Prism(GraphPad Software, Boston, MA, USA) 프로그램을 이용하여 실시하였다. 대조군과 처리군간 장내 미생물 조성의 차이는 LEfSe 분석으로 나타냈으며, 두 그룹 사이의 미생물 군집의 유의한 차이를 식별하기 위해 Kruskal-Wallis sum-rank 검정을 실시하여 LDA score가 2.0 이상인 것을 유의적인 차이를 나타낸다고 판단하였다. 장내 미생물 다양성 분포와 장내 면역세포 및 사이토카인과 항산화기능 관련 유전자의 발현에 대한 변화는 two-tailed unpaired t-test를 이용하여 분석하였다.

0)를 실시하여 유사 미생물 검출을 위한 분류 정보를 할당하였다. 미생물 군집 데이터를 비교, 분석하기 위해 QIIME2를 사용하여 ASV의 풍부도 및 분류 정보를 사용하였다. 샘플내 미생물 군집의 다양성과 균일성을 확인하기 위해 Shannon 지수와 Simpson 지수, Chao1 지수를 통해 알파 다양성을 확인하였다.

Paired-end read를 대상으로 Forward 서열(Read1)과 Reverse 서열(Read2)을 250 bp 또는 200 bp로 자르고, 예상오류가 2 이상인 시퀀스는 제외하여 amplicon sequence variant(ASV)을 생성하였다. 미생물 조성을 분석하기 위해 QIIME(v1.9)프로그램을 사용하여 전체 시료 중 최소판독 횟수를 가진 시료의 판독 횟수를 기준으로 subsampling 및 정규화를 진행하였다. 각 ASVs 서열은 Reference DB(NCBI 16S Microbial DB)에 BLAST+(v2.

육계 사료내 삼채뿌리분말의 첨가가 장내 미생물의 조성에 끼치는 영향과 장내 면역세포 및 사이토카인과 항산화기능 관련 유전자의 발현에 대한 결과의 통계분석은 Prism(GraphPad Software, Boston, MA, USA) 프로그램을 이용하여 실시하였다. 대조군과 처리군간 장내 미생물 조성의 차이는 LEfSe 분석으로 나타냈으며, 두 그룹 사이의 미생물 군집의 유의한 차이를 식별하기 위해 Kruskal-Wallis sum-rank 검정을 실시하여 LDA score가 2.

0 이상인 것을 유의적인 차이를 나타낸다고 판단하였다. 장내 미생물 다양성 분포와 장내 면역세포 및 사이토카인과 항산화기능 관련 유전자의 발현에 대한 변화는 two-tailed unpaired t-test를 이용하여 분석하였다. 통계분석 시 실험단위는 케이지이며 모든 통계분석에서 유의성은 0.

이론/모형

샘플내 미생물 군집의 다양성과 균일성을 확인하기 위해 Shannon 지수와 Simpson 지수, Chao1 지수를 통해 알파 다양성을 확인하였다. 육계 사료내 삼채뿌리분말의 첨가가 장내 미생물의조성변화에 미치는 영향을 확인하기 위해 Huttenhower Lab Galaxy Server 2.0에서 Linear discriminant analysis Effect size(LEfSe) (http://galaxy.biobakery.org/)를 실행하여 linear discriminant analysis(LDA) score를 확인하였다.

성능/효과

본 연구를 통해 육계에서 삼채뿌리분말이 첨가된 사료를 급여 시 장내 잠재적 유익균의 증가와 잠재적 병원균 속의 감소 등 장내 미생물 균총의 변화에서 긍정적인 효과를 확인하였고 장관면역세포인 T cell subset의 분포에 영향을 미침을 확인하였다. 또한 사이토카인 및 항산화기능 관련 유전자 발현에서는 GPX2가 증가하는 경향성을 확인하였다.

사료내 삼채뿌리분말 첨가가 육계의 장관 조직에서 사이토카인 및 항산화기능 관련 유전자 발현에 어떤 영향을 주는지 구명하기 위해 qRT-PCR 분석을 실시하였다. 본 연구에서 사료내 삼채뿌리분말 첨가가 육계 장관내 사이토카인 관련 유전자에 영향을 주는지 확인한 결과, 사이토카인 관련 유전자 발현에는 유의미한 차이를 관찰하지는 못하였다(Fig. 6A).

또한 사이토카인 및 항산화기능 관련 유전자 발현에서는 GPX2가 증가하는 경향성을 확인하였다. 이는 육계 사료내 삼채뿌리분말 첨가가 육계의 장내미생물을 긍정적인 방향으로 개선하여 장관면역이나 장건강을 향상시킬 수 있는 사료첨가제로 사용할 가능성이 있음을 나타낸다.

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이 논문을 인용한 문헌

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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