[논문]SV40의 T항원으로 불사화한 지방줄기세포주로부터 생산한 배양액의 항염증 효능

이예진; 이소영; 정민경; 박성문; 김동완

doi:10.5352/jls.2024.34.3.170

[국내논문] SV40의 T항원으로 불사화한 지방줄기세포주로부터 생산한 배양액의 항염증 효능
Anti-inflammatory Effect of Conditioned Medium From an Immortalized Adipose-derived Stem Cell Line by SV40 T Antigen

생명과학회지 = Journal of life science, v.34 no.3, 2024년, pp.170 - 178

이예진 (창원대학교 생명보건학부) , 이소영 (창원대학교 생명보건학부) , 정민경 (창원대학교 생명보건학부) , 박성문 (창원대학교 생명보건학부) , 김동완 (창원대학교 생명보건학부)

초록
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지방줄기세포는 다양한 세포로 분화할 수 있어서 세포치료제로 주목받고 있으나 세포 증식 속도가 느리고 세포의 수명이 짧아 임상 적용에 어려움이 있다. 본 연구팀은 선행연구에서 지방줄기세포의 증식속도를 향상시키고 세포 수명을 연장시키기 위해 SV40의 T항원 유전자를 사람의 ADSC에 도입하여 불사화시킨 ADSC 세포주를 제작하였으며 ADSC-T라고 명명하였다. 본 연구에서는 ADSC-T 세포의 분화능력을 검증하고, ADSC-T 세포를 배양하여 획득한 무혈청 배양액의 항염증 효능을 평가하였다. 그 결과, ADSC-T 세포주는 지방세포와 골세포로 분화할 수 있는 능력을 보유하고 있어 줄기세포의 가장 중요한 특징인 분화능력을 유지하고 있음을 알 수 있었다. 또한 ADSC-T의 배양액은 염증을 유발하는 NF-κB의 활성을 억제하였고, NF-κB의 표적 유전자인 COX-2와 iNOS의 발현도 억제하였다. 또한 ADSC-T 배양액은 ERK, JNK, p38의 인산화를 저해하여 세포 내 염증 유발 신호 전달 회로인 MAPKs 회로를 억제하는 것으로 나타났으며, 염증을 유발하는 cytokine인 TGF-β, TNF-α, IL-6, IL-13의 발현도 억제하는 효과를 보여 강한 항염증 효능이 있을 것으로 추정되었다. 실제로, 아토피 모델 쥐인 Nc/Nga 마우스를 DNCB로 처리하여 아토피 피부염을 유발한 뒤 ADSC-T 배양액을 도포한 결과 강한 치료 효과를 나타내었다. 이상의 결과로부터, 불사화된 ADSC-T 세포주는 지방줄기세포의 장점과 효능을 유지하고 있으며 향후 지방줄기세포의 세포 수급 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라 임상 적용이 가능한 배양액의 생산에도 널리 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Adipose-derived stem cells (ADSCs) are capable of differentiation into multiple lineages of cells, which has attracted attention for clinical therapy. However, ADSCs have poor proliferation capacity and a short life span in culture, which is an impediment in the application to clinical use. Previously, to overcome growth disadvantages, we had established an immortalized ADSC line (ADSC-T) by introducing the SV40 T antigen coding gene into primary human ADSC. In the present study, we evaluated the differentiation potential of this cell line and assessed the anti-inflammatory effect of its conditioned medium (CM). ADSC-T appeared to maintain the differentiation potential into adipocyte and chondrocyte. The CM of ADSC-T suppressed the NF-κB activity and its target gene expression of COX-2 and iNOS. Furthermore, the phosphorylations of MAPKs, including ERK, JNK and p38, were suppressed by the ADSC-T CM. The expressions of pro-inflammatory cytokines such as TGF-β, TNF-α, IL-6, and IL-13 were also suppressed by the CM of ADSC-T. In the Nc/Nga atopic model mice, the CM showed therapeutic effect on DNCB-induced atopic dermatitis. These results indicate that the immortalized ADSC-T maintains the beneficial properties of primary ADSC and could be a versatile cell source for not only research into ADSC but also for production of CM suitable for clinical application.

주제어

표/그림 (8)

그림 Fig. 1. Differentiation of ADSC-T into adipocyte. ADSC-T cells were cultured in DMEM (A) or adipogenic medium for 3 days and adipocyte maintenance medium for 10 days (B, C), and then the lipid droplets were photographed (magnification, ×100) (B). The adipocyte-induced cells were fixed in 10% formalin and stained with 50% Oil Red O solution (magnification, ×100)) (C). (D) Total mRNAs of ADSC-T cells cultured with DMEM (control) or adipogenic medium were isolated and assayed by RT-PCR.
표 Table 1. Primer sequences for RT-PCR
그림 Fig. 2. Differentiation of ADSC-T into osteocyte. ADSC-T cells were cultured in DMEM (A) or osteogenic medium for 3 days and osteocyte maintenance medium for 10 days (B), and the mineralized extracellular matrix was visualized by Von Kossa staining (magnification, ×100) (B). (C) Total mRNAs were isolated from ADSC-T cells cultured with DMEM (control) or osteogenic medium and assayed by RT-PCR.
그림 Fig. 3. Inhibition of NF-κB activity by conditioned medium of ADSC-T. COS-7 cells were co-transfected with pNL 3.2.-κB-RE plasmid and IKKβ-EE expression plasmid as indicated. After 24 hr, the cells were treated with 50% DMEM/F12 or 50% conditioned medium of ADSC-T (CM) for 48 hr. NF-κB activity was estimated by luciferase assay (A) (mean SD, n=3, *p<0.001), and proteins were detected by Western blotting (B).
그림 Fig. 4. Effect of conditioned medium of ADSC-T on the expression of NF-κB target genes. RAW 264.7 cells were treated with LPS and 50% DMEM/F12 or 50% conditioned medium of ADSC-T (CM) for 5 hr, and the expression level of COX-2 and iNOS was evaluated by Western blotting.
그림 Fig. 5. Suppression of MAPKs by the conditioned medium of ADSC-T. RAW 264.7 cells were treated with 0.25 μg/ml or 0.5 μg/ml of LPS together with 50% DMEM/ F12 or 50% conditioned medium of ADSC-T (CM) for 15 hr, and each protein was detected by Western blotting.
그림 Fig. 6. Effect of conditioned medium of ADSC-T on the expression of pro-inflammatory cytokines. RAW 264.7 cells were treated with 0.5 μg/ml of LPS and 50% DMEM/F12 or 50% CM of ADSC-T for 12 hr. The mRNA levels were measured by RT-PCR. GAPDH was used as an internal control.
그림 Fig. 7. Anti-atopic effect of ADSC-T conditioned medium. Nc/Nga mice were treated with 0.5% DNCB (1-chloro-2, 4-dinitrochlorobenzen) for 20 days to induce atopic inflammation and then treated with 0.5% DNCB together with DMEM/F12 or conditioned medium of ADSC-T (CM) for 20 days.

AI 본문요약
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문제 정의

ADSC-T의 CM이 NF-κB의 활성을 억제하였으므로 염증성 자극이 주어진 세포에서 ADSC-T의 CM이 COX-2와 iNOS의 발현도 억제하는지 검토하였다
본 연구팀은 선행연구에서 이러한 ADSC 세포수급 문제를 해결하기 위해 ADSC에 simian virus 40 (SV40)의 T항원 유전자를 도입하여 불사화(immortalization)시킨 지방 줄기세포주를 개발하여 ADSC-T라 명명하였으며, 이 세포주가 primary ADSC에 비해 증식속도가 향상되고 세포수명이 연장되었음을 보고한 바 있다[10, 11]. 본 연구에서는 ADSC-T의 분화능력을 검토하여 지방줄기세포주로서의 이용가치를 판정하고, ADSC-T를 혈청이 첨가되지 않은 무혈청 배지로 배양하여 생산한 무혈청 배양상등액(serum-free conditioned medium)의 항염증 효능을 검토하여 염증치료제 및 화장품의 원료로 활용할 수 있는 근거를 마련하였다.
이러한 세포수급의 문제로 인하여 기초연구를 위해 다수의 공여자로부터 채취한 ADSC를 이용할 경우 세포성질의 개인적 차이로 인하여 연구결과의 일관성이 없고[6, 15], 세포의 부족으로 인해 ADSC의 약리기전에 대한 기초 연구는 충분히 이루어지지 않고 있으며, 이로 인해 ADSC를 활용한 치료제의 개발도 지연되고 있는 실정이다. 본 연구팀은 선행연구에서 이러한 ADSC 세포수급 문제를 해결하기 위해 ADSC에 simian virus 40 (SV40)의 T항원 유전자를 도입하여 불사화(immortalization)시킨 지방 줄기세포주를 개발하여 ADSC-T라 명명하였으며, 이 세포주가 primary ADSC에 비해 증식속도가 향상되고 세포수명이 연장되었음을 보고한 바 있다[10, 11]. 본 연구에서는 ADSC-T의 분화능력을 검토하여 지방줄기세포주로서의 이용가치를 판정하고, ADSC-T를 혈청이 첨가되지 않은 무혈청 배지로 배양하여 생산한 무혈청 배양상등액(serum-free conditioned medium)의 항염증 효능을 검토하여 염증치료제 및 화장품의 원료로 활용할 수 있는 근거를 마련하였다.

제안 방법

ADSC-T CM이 염증을 유발하는 NF-κB와 MAPKs 회로를 억제하고 COX-2, iNOS 및 pro-inflammatory cytokine의 발현을 억제하는 것으로 나타났으므로 실제로 염증 질환에 치료 효과가 있는지 알아보기 위해 아토피 모델 마우스인 NC/Nga를 이용하여 아토피 피부염 치료 효과를 검토하였다[4, 22]
ADSC-T의 분화능력을 더욱 검증하기 위하여 골세포(osteocyte) 분화를 유도하였다. ADSC-T를 골세포 유도 배지에서 3일간 배양하여 골세포 분화를 유도하였으며 그 후 골세포 유지 배지에서 10일간 배양한 후 분화 여부 판정을 위하여 Von Kossa 염색을 실시하였다. 그 결과 분화를 유도한 ADSC-T에서 extracellular matrix의 무기질화(mineralization)가 Von Kossa 염색으로 확인되었다(Fig.
ADSC-T의 분화능력을 더욱 검증하기 위하여 골세포(osteocyte) 분화를 유도하였다. ADSC-T를 골세포 유도 배지에서 3일간 배양하여 골세포 분화를 유도하였으며 그 후 골세포 유지 배지에서 10일간 배양한 후 분화 여부 판정을 위하여 Von Kossa 염색을 실시하였다.
COS-7 세포에 reporter plasmid와 IKKβ-EE 발현 plasmid를 transfection하고 24시간 후 무혈청 기본 배지인 DMEM/F12와 ADSC-T를 DMEM/F12로 배양한 무혈청 배양 상등액(CM)을 각각 50%씩 첨가하여 48시간 경과 후 luciferase assay를 실시하였다
실험은 아주대학교 동물실험센터에서 수행되었으며 동물실험윤리가이드를 준수하였다(승인번호 2020-003). NC/Nga 마우스에 사람과 유사한 아토피 피부염을 유발하기 위하여 0.5% DNCB (1-chloro-2, 4-dinitrochlorobenzene)를 아세톤과 Olive oil에 섞어 제모한 마우스의 등에 매일 도포하였으며 20일 후에는 매일 DNCB 용액 도포 후 7시간 뒤에 대조군(control)으로 DMEM/F12를 도포하고 실험군(CM군)에는 ADSC-T CM을 도포하였다. 그 결과 Fig.
Primary ADSC 세포에 SV40의 T 항원 유전자를 도입하여 증식속도를 높이고 세포의 수명을 연장시킨 ADSC-T 세포가 줄기세포의 성질을 유지하고 있는지 확인하기 위하여 줄기세포의 가장 중요한 특징인 분화능력을 검토하였다. ADSC는 중간엽줄기세포로서 지방세포(adipocyte), 골세포(osteocyte), 연골세포(chondrocyte) 등 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진다[23].
Luciferase activity를 측정하기 위하여 Nano-Glo Substrate (Promega)를 Nano-Glo buffer (Promega)에 100배 희석하여 사용하였으며 cell lysate는 96-well plate에 20 μl 씩 분주하여 사용하였다. Substrate는 luminometer program (Microwin assay reader 2000, Centro LB960 Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany)을 이용하여 노즐을 70% ethanol로 50회 wash하고 멸균 증류수로 50회 wash 한 후 투여하였다. 효소반응은 20 μl 씩 substrate가 분주되도록 하였으며 luciferase activity를 10초 간격으로 측정하였다.
이에 따라 ADSC-T CM이 MAPKs 회로에 미치는 영향을 검토하고자 RAW 264.7 세포에 LPS를 0.25 μg/ml, 0.5 μg/ml의 농도로 처리하여 염증반응을 유발시킨 뒤, DMEM/F12 기본 배지와 ADSC-T CM을 각각 50% 농도로 처리하였다

데이터처리

결과는 Graphpad prism 5를 이용하여 평균(mean)표준편차(SD)로 나타내었다. one way ANOVA와 T-test를 이용하여 통계적 유의성을 분석하였다. p값이 0.
실험은 3회 반복하였고. 결과는 Graphpad prism 5를 이용하여 평균(mean)표준편차(SD)로 나타내었다. one way ANOVA와 T-test를 이용하여 통계적 유의성을 분석하였다.

이론/모형

본 실험에서는 ADSC-T 세포를 무혈청 배지로 배양한 배양 상등액(conditioned medium, CM)이 NF-κB의 활성을 억제하는 효능을 가지는지 검토하기 위하여 pNL3.2-κB-RE luciferase reporter plasmid (Promega, code N1111)를 이용하였다

성능/효과

그 결과 Fig. 4에 나타난 바와 같이 COX-2와 iNOS 모두 LPS의 농도가 증가함에 따라 발현량이 증가하였으며, ADSC-T의 CM이 첨가된 경우 기본 배지인 DMEM/F12가 첨가된 경우에 비해 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. DMEM/F12 기본배지는 LPS의 작용에 영향을 주지 않았다 (data not shown).
5 μg/ml의 농도로 처리하여 염증반응을 유발시킨 뒤, DMEM/F12 기본 배지와 ADSC-T CM을 각각 50% 농도로 처리하였다. 그 결과, ERK의 경우 ADSC-T CM의 처리에 의해 ERK의 발현량에는 차이가 없었으나 ERK의 인산화(p-ERK)에 차이를 보였다. CM을 15시간 처리하였을 때 LPS에 의해 증가한 p-ERK가 감소하였으며 특히 LPS 0.
다음은 MAPKs 회로의 활성화에 의해 발현이 증가하여 염증을 유발하는 것으로 알려진 pro-inflammatory cytokines가 ADSC-T CM에 의해 발현이 억제되는지 검토하기 위해 RAW 264.7 세포를 LPS (0.5 μg/ml)와 50%의 DMEM/F12 또는 50% ADSC-T CM으로 처리한 후 RT-PCR을 실시한 결과 LPS에 의해 mRNA 생산이 증가한 TGF-β, TNF-α, IL-6, IL-13이 ADSC-T CM에 의해 mRNA 생산이 감소한 것으로 나타나 ADSC-T CM이 pro-inflammatory cytokine의 생산을 억제하여 항염증 작용을 하는 것을 알 수 있었다(Fig
2A). 또한 골세포 분화를 유도한 ADSC-T로부터 total mRNA를 분리하여 골세포에서 특이적으로 발현되는 RUNX-2와 osteopontin의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과 분화를 유도하지 않은 control에 비하여 분화를 유도한 세포에서 많은 양의 mRNA가 발현됨을 확인하였다(Fig. 2C).
또한 이러한 NF-κB의 활성 억제가 NF-κB의 저해제인 IκBα의 분해 억제에 의한 것인지 확인하기 위하여 세포 내 IκBα의 양을 비교한 결과 IKKβ-EE에 의해 감소한 IκBα가 CM을 첨가한 경우 증가한 것으로 나타났다(Fig
또한 지방세포 분화를 유도한 ADSC-T로부터 total mRNA를 분리하여 지방세포에서 특이적으로 생산되는 PPAR-γ2와 Adipsin의 mRNA 양을 RT-PCR로 검토한 결과 분화를 유도한 ADSC-T에서 다량으로 검출되어 ADSC-T는 지방세포로 분화할 수 있는 능력을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다(Fig
이러한 분화능력은 줄기세포의 가장 중요한 필수기능이라 할 수 있다. 먼저 지방세포 분화능력을 검토하기 위하여 지방세포 분화 유도 배지에서 3일간 배양한 결과 ADSC-T의 세포 내에 지방립이 형성되는 것을 현미경으로 관찰할 수 있었고, 분화 유지 배지에서 10일간 추가로 배양한 후에는 많은 양의 지방립이 형성됨을 현미경 관찰로 확인하였으며(Fig. 1B), 이는 Oil Red O 염색을 통하여 지방립임을 증명하였다(Fig.
5A). 이 결과로부터 ADSC-T CM은 ERK 회로를 억제함을 알 수 있었다. JNK의 경우도 마찬가지로 LPS에 의해 증가한 p-JNK가 CM을 15시간 처리하였을 때 감소한 것으로 나타났으며 LPS 0.
5C). 이 결과로부터 ADSC-T CM은 MAPKs 회로를 억제함을 알 수 있었다.
2C). 이 결과로부터 ADSC-T는 지방세포뿐아니라 골세포로도 분화할 수 있음을 확인하였으며, 이로 부터 ADSC-T가 T항원 도입에 의해 immortalization 된 후에도 줄기세포의 중요한 기능인 분화능력을 보유함을 알 수 있었다.
이 결과로부터 ADSC-T의 CM은 NF-κB를 억제함으로써 염증을 유발하는 NF-κB의 target gene의 발현도 억제하여 항염증 작용을 할 것으로 판단할 수 있었다.
7에 나타난 바와 같이 DNCB 도포 20일 후에 도포 부위에 상처의 혈액과 진물이 두꺼운 가피를 형성하여 아토피 피부염이 유발되었고 DMEM/F12를 도포한 대조군에서는 계속해서 아토피 병변이 유지되었으나 ADSC-T CM을 도포한 실험군에서는 도포 10일 후부터 가피가 벗겨지고 상처가 치유되기 시작하였으며 도포 20일 후에는 염증이 대부분 사라진 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터 ADSC-T의 CM은 아토피 피부염 치료 효과가 있음을 증명할 수 있었다.
이러한 결과는 CM에 의한 NF-κB의 억제가 세포 내 NF-κB 저해 물질인 IκBα의 분해 억제로 인한 IκBα의 증가 때문인 것으로 보여지며 이는 CM에 IKK complex의 활성 저해인자가 함유되어 있을 가능성을 시사하는 것으로 보여진다.
향후 줄기세포 연구개발의 세계적 추세는 줄기세포 이식에 의한 부작용과 위험성이 없이 줄기세포 효능을 불특정 다수에게 활용하는 범용성의 확대로 나아갈 것으로 추정하고 있으며 이를 위해 줄기세포 배양액의 활용이 주목받고 있다. 이러한 관점에서 ADSC를 immortalization시켜 만든 ADSC-T 세포주는 지방줄기세포의 연구 목적을 위한 세포의 공급뿐 아니라 높은 효능을 보유한 지방줄기세포의 배양액 생산에도 널리 이용될 수 있는 우수한 세포주라고 사료된다.
특히 ADSC-T를 혈청이 함유되지 않은 무혈청배지로 배양하여 생산한 배양상등액(CM)이 인체에 염증을 유발하는 핵심 물질인 NF-κB를 저해하고, NF-κB의 대표적 target gene인 COX-2와 iNOS의 발현을 억제하였을 뿐 아니라 MAPKs를 구성하는 ERK, JNK, p38 모두 ADSC-T CM에 의해 인산화가 저해되는 것으로 나타나 MAPK 회로가 ADSC-T CM에 의해 억제됨이 밝혀졌으며, 세포 내 대표적인 pro-inflammatory cytokine인 TGF-β, TNF-α, IL-6, IL-13의 발현이 ADSC-T CM에 의해 저해됨이 본 연구에 의해 밝혀져 ADSC-T CM은 강한 항염증 작용을 할 것으로 추정되었고, 실제로 아토피 모델인 NC/Nga 마우스에서 아토피 치료 효과가 확인되었다

후속연구

지방줄기세포 연구의 가장 큰 장애물은 충분한 연구용 세포수급이 어려운 점과 지방 공여자에 따라 지방 줄기세포의 성질의 차이로 인한 연구결과의 차이일 것이다. ADSC-T는 빠른 증식속도와 세포수명의 연장으로 동일한 성질의 세포를 대량으로 공급이 가능하여 세포 수급 문제를 해결할 수 있으며, 앞으로 지방줄기세포의 분화 연구, 세포증식 연구, 세포치료제 연구 등 광범위한 줄기세포 연구에 활용될 수 있을 것이다. 특히 ADSC-T를 혈청이 함유되지 않은 무혈청배지로 배양하여 생산한 배양상등액(CM)이 인체에 염증을 유발하는 핵심 물질인 NF-κB를 저해하고, NF-κB의 대표적 target gene인 COX-2와 iNOS의 발현을 억제하였을 뿐 아니라 MAPKs를 구성하는 ERK, JNK, p38 모두 ADSC-T CM에 의해 인산화가 저해되는 것으로 나타나 MAPK 회로가 ADSC-T CM에 의해 억제됨이 밝혀졌으며, 세포 내 대표적인 pro-inflammatory cytokine인 TGF-β, TNF-α, IL-6, IL-13의 발현이 ADSC-T CM에 의해 저해됨이 본 연구에 의해 밝혀져 ADSC-T CM은 강한 항염증 작용을 할 것으로 추정되었고, 실제로 아토피 모델인 NC/Nga 마우스에서 아토피 치료 효과가 확인되었다.
특히 ADSC-T를 혈청이 함유되지 않은 무혈청배지로 배양하여 생산한 배양상등액(CM)이 인체에 염증을 유발하는 핵심 물질인 NF-κB를 저해하고, NF-κB의 대표적 target gene인 COX-2와 iNOS의 발현을 억제하였을 뿐 아니라 MAPKs를 구성하는 ERK, JNK, p38 모두 ADSC-T CM에 의해 인산화가 저해되는 것으로 나타나 MAPK 회로가 ADSC-T CM에 의해 억제됨이 밝혀졌으며, 세포 내 대표적인 pro-inflammatory cytokine인 TGF-β, TNF-α, IL-6, IL-13의 발현이 ADSC-T CM에 의해 저해됨이 본 연구에 의해 밝혀져 ADSC-T CM은 강한 항염증 작용을 할 것으로 추정되었고, 실제로 아토피 모델인 NC/Nga 마우스에서 아토피 치료 효과가 확인되었다. 향후 줄기세포 연구개발의 세계적 추세는 줄기세포 이식에 의한 부작용과 위험성이 없이 줄기세포 효능을 불특정 다수에게 활용하는 범용성의 확대로 나아갈 것으로 추정하고 있으며 이를 위해 줄기세포 배양액의 활용이 주목받고 있다. 이러한 관점에서 ADSC를 immortalization시켜 만든 ADSC-T 세포주는 지방줄기세포의 연구 목적을 위한 세포의 공급뿐 아니라 높은 효능을 보유한 지방줄기세포의 배양액 생산에도 널리 이용될 수 있는 우수한 세포주라고 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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