[논문]겨자무 아임계수 추출물의 항산화활성 및 미백효과

김인재; 은수빈; 김원희; 박선빈; 구희빈; 김교남; 이승철; 최영임; 박상근; 박해룡

doi:10.5352/jls.2024.34.4.236

겨자무 아임계수 추출물의 항산화활성 및 미백효과
Whitening Effect and Antioxidant Activity of Horseradish Subcritical Water Extracts 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.34 no.4, 2024년, pp.236 - 244

김인재 (경남대학교 제약공학과) , 은수빈 (경남대학교 제약공학과) , 김원희 (경남대학교 제약공학과) , 박선빈 (경남대학교 제약공학과) , 구희빈 (경남대학교 제약공학과) , 김교남 (경남대학교 제약공학과) , 이승철 (경남대학교 제약공학과) , 최영임 ((주)대력) , 박상근 ((주)대력) , 박해룡 (경남대학교 제약공학과)

초록
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Melanin은 대부분의 식물과 동물에서 발견되는 자연 색소로, 피부와 모발의 색을 결정하는 게 관여한다. Melanogenesis는 일반적으로 피부를 자외선과 같은 외부 자극으로부터 보호하기 위한 반응으로 melanocyte에서 수행한다. Tyrosinase는 기질인 tyrosine을 melanin으로 생합성 하는데 관여한다. 그러나 melanin의 과다 생성은 melasma, blotch, hyperpigmentation, 그리고 피부암과 같은 피부질환으로 이어질 수 있다. Kojic acid 및 arbutin과 같은 미백 물질에 대한 연구가 수행되었지만, 부작용으로 인해 일부 국가에서는 사용을 금지하거나 제한하고 있다. 따라서 본 연구에서는 기능성화장품의 새로운 미백재료로서 잠재력을 연구하기 위해 겨자무(horseradish)를 선택하였다. 더 나아가 효율적인 추출을 위해 아임계수 추출을 사용하였다. 연구 결과, 아임계수 200℃ 추출물은 높은 DPPH 라디칼 소거능, 총 페놀 함량, tyrosinase 저해능 그리고 B16-F10 melanoma 세포주의 melanin 생성 억제 효과를 나타내었다. B16-F10 melanoma 세포주에 대한 세포 독성을 조사하기 위해 MTT reduction assay 및 형태학적 변화를 관찰하였으며, 그 결과, 겨자무 methanol 추출물 및 아임계수 200℃에서는 세포독성이 확인되지 않았다. 결론적으로, 이 연구는 화장품의 천연 미백 기능성소재로서 가능성을 제안하는 바이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Melanin is a natural pigment found in most plants and animals, and it is involved in determining the color of the skin and hair. Melanogenesis is a reactive occurrence in melanocytes aiming to protect the skin from external stimuli, such as ultraviolet rays. Tyrosine is involved in the biosynthesis of the substrate tyrosine into melanin. However, melanin overproduction can lead to skin diseases, such as melasma, blotching, hyperpigmentation, and skin cancer. Although many studies have been conducted on whitening substances, such as kojic acid and arbutin, some countries have banned or refrained from using them due to their side effects. Therefore, this study assessed the potential of horseradish (HR) as a new whitening agent in cosmetic products. For efficient extraction, subcritical water extraction was conducted. The results showed that the horseradish subcritical water 200℃ (SW 200) extract showed high DPPH radical scavenging ability, total phenolic contents (TPC), inhibiting tyrosinase activity and inhibiting melanin production of B16-F10 melanoma cell lines. To investigate its cytotoxicity to the B16-F10 melanoma cell lines, MTT reduction assay and morphological changes were observed. No cytotoxicity was found in horseradish methanol extract and SW 200. In conclusion, this research suggests the possibility of horseradish subcritical water may be useful as a natural whitening ingredient to be used in cosmetic products.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Tyrosinase inhibition effects of horseradish methanol (MeOH) and subcritical water 200℃ (SW 200) extracts. Arbutin (Arb) was used for positive control. Data are presented as mean ± SD of three measurements. Samples are same as Table 1. ***significantly different from arbutin-treated control group (p<0.001).
표 Table 1. Contents of total phenols of horseradish extracts
표 Table 2. DPPH radical scavenging activity of horseradish extracts (Unit: %)
그림 Fig. 2. Cell viability of horseradish extracts in B16-F10 melanoma cells. (A) MTT reduction assay of B16-F10 melanoma cells with horseradish methanol (MeOH) and subcritical water 200℃ (SW 200) extracts at doses of 10 and 100 μg/mL. Cells were incubated for 24 hr before treated with horseradish extracts. (B) Morphological assay of B16-F10 melanoma cells with horseradish methanol (MeOH) and subcritical water 200℃ (SW 200) extracts. a, MeOH-control; b, MeOH-10 μg/mL; c, MeOH-100 μg/mL; d, SW 200℃-control; e, SW 200℃-10 μg/mL; f, SW 200℃-100 μg/mL. Samples are same as Table 1.
그림 Fig. 3. Effects of melanin inhibition in B16-F10 melanoma cells treated with horseradish methanol (MeOH) and subcritical water 200℃ (SW 200) extracts at doses of 10 and 100 μg/mL. Cells were incubated for 24 hr before treated with horseradish extracts and malanin was induced by IBMX 1 mM. Data are presented as mean ± SD of three measurements. Samples are same as Table 1. Significant vs. IBMX-treated control group (**: p<0.01; ***: p<0.001).
그림 Fig. 4. Expression of proteins from B16F10 melanoma cells treated with IBMX. IBMX expressed tyrosinase and values of tyrosinase expression treated with IBMX. Cells were with treated IBMX at a concentration of 1 mM for 12, 24, 48, and 72 hr. Primary antibodies, goat polyclonal tyrosinase (1:500) and mouse monoclonal anti-β-actin (1:2,000) were reacted for 2 hr. Then, secondary antibodies of anti-goat immunoglobin antibody (1:500) and anti-mouse immunoglobin antibody (1:2,000) were added at room temperature for 1 hr.
그림 Fig. 5. Expression of proteins from B16F10 melanoma cells treated with horseradish subcritical water 200℃ (SW 200) extracts. SW 200 suppressed tyrosinase expression and values of tyrosinase expression treated with horseradish subcritical water 200℃ (SW 200) extracts. Cells were treated with horseradish subcritical water 200℃ (SW 200) extracts at concentrations of 10, 50, 100 μg/mL, and 1 mM IBMX for 72 hr. Primary antibodies, goat polyclonal tyrosinase (1:500) and mouse monoclonal anti-ß-actin (1:2,000) reacted for 2 hr. Secondary antibodies of anti-goat immunoglobin antibody (1:500) and anti-mouse immunoglobin antibody (1:2,000) were added for 1 hr.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 겨자무를 150℃ 와 200℃의 아임계수 및 methanol, ethanol, acetone으로 추출하여 다양한 생리활성을 비교 분석하기 위해 TPC, DPPH, tyrosinase inhibition, MTT reduction, melanin content assay 및 western blotting을 실시하여, 겨자무의 아임계수 추출물을 이용한 미백 기능성화장품으로서의 새로운 가능성을 제시하고자 한다.

제안 방법

겨자무 추출물의 생리활성을 용매별로 측정하기 위해 용매를 아임계수, methanol, ethanol 및 acetone을 사용하였고 아임계수 추출 온도는 150℃와 200℃로 설정하였다.
겨자무의 미백 활성을 측정하기 위해 아임계수 200℃와 methanol 추출물을 농축하였다. 농축법은 아임계수 200℃ 추출물(1 mL)과 methanol 추출물(10 mL)을 각 다른 25 mL 농축플라스크에 담아 회전진공농축기(EYLYA N-1110, Tokyo, Japan)를 이용하였다.
겨자무의 아임계수 200℃ 및 methanol 추출물을 각각 10, 100 μg/mL의 최종처리농도가 되도록 처리하였다
겨자무의 유기용매 및 아임계수 추출물의 항산화 효과를 우선적으로 비교하기 위해 DPPH assay 및 총 페놀 함량을 구하였다. 그 결과 평균적으로 약 6%의 DPPH 라디칼 소거능을 보여주었던 유기용매 추출물에 비해, 아임계수 200℃ 추출물에서 33.
멜라닌 색소를 생성하는 B16-F10 melanoma 세포주의 멜라닌 생성 억제 효과를 알아보기 위해 멜라닌 정량 실험을 진행하였고, 최종처리농도는 각 용매 별로 10 μg/mL 및 100 μg/mL이 되도록 처리하였다
피부에 접촉하는 화장품의 원료로서 안전성을 확인하기 위해 겨자무의 세포독성 평가를 하였다. 멜라닌 색소를 형성하는 B16-F10 melanoma 세포주의 cell growth에 대해 겨자무가 영향을 미치는지 알아보기 위해 MTT reduction assay와 Morphological analysis를 실시하여 세포독성을 측정하였다. 겨자무의 아임계수 200℃ 및 methanol 추출물을 각각 10, 100 μg/mL의 최종처리농도가 되도록 처리하였다.
멜라닌 색소생성의 중요한 단계를 촉매하는 효소인 tyrosinase의 저해 활성을 알아보기 위해 tyrosinase inhibition assay를 실시하였고, 최종처리농도는 각 용매 별로 10 μg/mL 및 100 μg/mL이다
시료로는 농축한 아임계수 200℃ 및 methanol 추출물을 DMSO로 최종처리농도가 10 μg/mL 및 100 μg/mL 되도록 처리하여, 양성대조군인 arbutin을 100 μg/mL로 희석한 것과 활성을 비교하였다.
3 μg GAE/mL의 높은 총 페놀 함량을 보여주었다. 이 후 겨자무의 유기용매 및 아임계수 추출물의 미백활성 및 B16-F10에 대한 세포독성을 비교하기 위해 실험에 사용된 유기용매 중 비교적 높은 항산화 효과를 지닌 methanol 추출물을 선별하여 실험을 진행하였다.
피부에 접촉하는 화장품의 원료로서 안전성을 확인하기 위해 겨자무의 세포독성 평가를 하였다. 멜라닌 색소를 형성하는 B16-F10 melanoma 세포주의 cell growth에 대해 겨자무가 영향을 미치는지 알아보기 위해 MTT reduction assay와 Morphological analysis를 실시하여 세포독성을 측정하였다.

대상 데이터

Phosphate-buffered saline, 10×는 Welgene, Inc. (Gyeongsan, Korea)로 부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dullbecco’s modified Eagles’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), 0.
Louis, MO, USA)로 부터 구입하였고, Sodium phosphate monobasic anhydrous, Sodium hydroxide 및 Sodium phosphate dibasic anhydrous는 DaeJung Chemicals & Metals Co. (Siheung, Korea)로 부터 구입하였다. Phosphate-buffered saline, 10×는 Welgene, Inc.
본 실험에 사용된 mouse 유래 흑색종 세포주 B16-F10 melanoma는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 세포배양을 위해 DMEM에 10% FBS 및 100 units/mL의 penicillin을 첨가하여 사용하였고, 95% 습도가 유지되는 37℃, CO2 incubator (MCO-18-AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
본 실험에 사용한 겨자무를 분말 형태로 (주)대력에서 제공받았다. 실험에 사용된 시약과 시료인 Folin & Ciocalteu’s phenol reagent, Gallic acid, L-tyrosine, Tyrosine from mushroom, DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhdrazl), arbutin, dimethyl sulfoxide (DMSO), 및 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), Thiazolyl blue tetrazolium bromide는 Sigma Chemical Co.
세포배양을 위해 DMEM에 10% FBS 및 100 units/mL의 penicillin을 첨가하여 사용하였고, 95% 습도가 유지되는 37℃, CO2 incubator (MCO-18-AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다. 세포배양과 관련된 시약류는 ㈜대력에서 제공받아 사용하였다.

데이터처리

각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)을 구하였다
겨자무 추출물의 tyrosinase 저해 활성 및 멜라닌 생합성 억제 활성의 정도를 비교하기 위해서 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 scheffe’s test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다

이론/모형

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay는 겨자무의 각 용매 및 온도 별 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위해 사용하였다. 추출물 시료를 20 μL에 0.
IBMX 처리 후 단백질의 발현 시간과 아임계수 200℃ 추출물의 단백질 발현 억제 활성을 알아보기 위해 western blotting을 실시하여, Fig. 4와 Fig.
Tyrosinase inhibition assay는 겨자무의 각 용매 및 온도별 추출물의 미백 활성을 확인하기 위해 사용하였다. 96 well plate의 각 well에 시료를 20 μL, 0.

성능/효과

MTT reduction assay 결과는 추출물 처리를 하지 않은 대조군과 비교하여 나타난 세포독성을 분석하였을 때, methanol 추출물 10 μg/mL (101.3%), methanol 추출물 100 μg/mL (110.6%)은 세포 독성이 확인되지 않지만, 아임계수 200℃ 추출물 10 μg/mL (93.2%) 및 아임계수 200℃ 추출물 100 μg/mL (86.2%)에서 낮은 세포 독성을 관찰할 수 있었다
Methanol 추출물 10 μg/mL (24.18%)는 아임계수 200℃ 추출물 10 μg/mL보다 낮은 멜라닌 함량을 나타내었지만, Methanol 추출물 100 μg/mL (18.94%)는 아임계수 200℃추출물 100 μg/mL보다 높은 멜라닌 함량인 것을 보았을 때, 아임계수 200℃ 추출물이 methanol 추출물보다 농도 의존적으로 높은 멜라닌 생성 억제 효과를 가진다고 볼 수 있다.
Methanol 추출물 100 μg/mL (9.87%) 보다 아임계수 200℃ 추출물 10 μg/mL (11.68%)의 활성이 더 높은 것으로 보아, 대체적으로 아임계수 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 methanol 추출물보다 높다고 볼 수 있다
Methanol, ethanol 그리고 acetone 추출물 중 methanol 추출물이 가장 높은 총 페놀 함량(43.5 μg GAE/mL)을 나타내었지만, 아임계수 150℃ 추출물이 methanol 추출물보다 34.2배 높은 총 페놀 함량을 나타내었다.
겨자무의 유기용매 및 아임계수 추출물의 항산화 효과를 우선적으로 비교하기 위해 DPPH assay 및 총 페놀 함량을 구하였다. 그 결과 평균적으로 약 6%의 DPPH 라디칼 소거능을 보여주었던 유기용매 추출물에 비해, 아임계수 200℃ 추출물에서 33.4%로 상대적으로 높은 항산화 활성을 확인할 수 있었다. 또한, 아임계수 200℃ 추출물이1,682.
그 중 아임계수 200℃ 추출물 100 μg/mL (7.3%)에서 가장 낮은 멜라닌 함량을 나타내었으며, 아임계수 200℃ 추출물 10 μg/mL (25.61%)에서 가장 높은 멜라닌 함량을 나타내었다
세포는 외부 환경에 민감하게 자극을 받으면 상해를 입는 것과 동시에 세포사가 유도되어 형태학적인 변화가 일어나는데, B16-F10 melanoma 세포주의 형태학적인 변화를 관찰한 결과, methanol 추출물 10 μg/mL, 100 μg/mL 및 아임계수 200℃ 추출물 10 μg/mL, 100 μg/mL 모두 용매 별 control과 유의적인 차이가 없음을 알 수 있다. 따라서 겨자무의 아임계수 200℃ 및 methanol 추출물 모두 세포독성이 적다고 볼 수 있다.
또한, 아임계수 200℃ 추출물이1,682.3 μg GAE/mL의 높은 총 페놀 함량을 보여주었다
5%)을 나타내었다. 서로 비슷하게 나타난 methanol 추출물(6.3%)과 ethanol 추출물의 활성(6.1%)은 아임계수 200℃에 비해 항산화 활성이 약 6배 낮게 나타났지만, 아임계수 150℃ 추출물(4.2%)보다 높은 활성을 나타내었다. 아임계수 200℃ 추출물과 아임계수 control (69.
세포는 외부 환경에 민감하게 자극을 받으면 상해를 입는 것과 동시에 세포사가 유도되어 형태학적인 변화가 일어나는데, B16-F10 melanoma 세포주의 형태학적인 변화를 관찰한 결과, methanol 추출물 10 μg/mL, 100 μg/mL 및 아임계수 200℃ 추출물 10 μg/mL, 100 μg/mL 모두 용매 별 control과 유의적인 차이가 없음을 알 수 있다
2%)보다 높은 활성을 나타내었다. 아임계수 200℃ 추출물과 아임계수 control (69.6%)의 활성을 비교해 보았을 때, 아임계수 200℃로 추출한 겨자무 추출물의 항산화 활성이 비교적 높은 것을 알 수 있다.
아임계수 200℃ 추출물을 제외하고 다른 온도와 용매의 추출물들은 비교적 낮은 활성을 나타내었다. 아임계수 200℃ 추출물이 가장 높은 활성(33.4%)을 나타내었으며, 다른 용매 중 acetone 추출물이 가장 낮은 활성(1.5%)을 나타내었다. 서로 비슷하게 나타난 methanol 추출물(6.
아임계수 추출물 중 아임계수 200℃ 추출물이 가장 높은 총 페놀 함량(1682.3 μg GAE/mL)을 나타내었으며, 아임계수 150℃ 추출물이 가장 낮은 총 페놀 함량(1490.7 μg GAE/mL)을 나타내었다
이후, 아임계수 200℃ 추출물을 처리 후 IBMX를 72시간 처리하였을 때, 농도의존적으로 tyrosinase는 억제되었다. 이를 통해, 아임계수 200℃ 추출물은 tyrosinase의 활성뿐만 아니라, tyrosinase의 발현을 억제하는 것을 알 수 있다.
IBMX를 B16-F10 melanoma 세포주에 처리한 결과, 시간 의존적으로 tyrosinase 발현이 증가하였고, 72시간 처리하였을 때 가장 높게 나타났다. 이후, 아임계수 200℃ 추출물을 처리 후 IBMX를 72시간 처리하였을 때, 농도의존적으로 tyrosinase는 억제되었다. 이를 통해, 아임계수 200℃ 추출물은 tyrosinase의 활성뿐만 아니라, tyrosinase의 발현을 억제하는 것을 알 수 있다.
각 다른 용매 및 온도로(아임계수 150℃, 200℃; methanol; ethanol; acetone) 추출한 겨자무 추출물의 총 페놀 함량은 Table 1에 나타내었다. 전체적으로 다른 용매에 비해 아임계수 추출물(150℃, 200℃)의 총 페놀 함량이 평균적으로 가장 높게 나타났다. 아임계수 추출물 중 아임계수 200℃ 추출물이 가장 높은 총 페놀 함량(1682.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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