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문제 정의
- oleovorans를 배양할 경우 4 g/L 이상의 octanoic acid 농도에서는 균체 성장이 저해됨이 알려져 있다.2) 또한 배양액중 탄소원이 고갈되면 균체내에 합성된 PHA가 분해되므로 본 연구에서는 배양액중의 octanoic acid 농도를 0 - 4 g/L로 유지하고자 하였다. 지금까지 문헌에 보고된 P.
- 따라서 MCL-PHA의 경우, 현재로서는 범용 플라스틱을 대체하기 보다는 생산단가에 영향을 덜 받는 의료용 재료 또는 특수용도로의 활용이 더 적합할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 MCL-PHA의 경제적 생산을 위한 Pseudomonas oleovorans2\ 고농도 유가식 발효공정을 개발하고자 하였 다.
제안 방법
- P. oleovorans의 유가식 배양에서 탄소원으로 octanoic acid, 질소원으로 NH4NO3를 이용한 혼합기질을 배양액의 pH 변화에 따라 공급하는 pH-stat 기질공급전략을 개발하였다. 공급기 질의 탄소원/질소원 비 (C/N 비)를 변화시킴으로써 최종 균체 농도, PHA 농도, PHA 함량 등을 변화시킬 수 있었으며, 최대 균체 농도는 C/N 비가 10 (g octanoic acid/g NH4NO3)일 때 65 g/L, 최대 PHA 농도는 C/N 비가 20일 때 41 g/L, 최대 PHA 함량은 C/N 비가 20일 때 75%였으며 최대 PHA 생산성은 C/N 비가 10일 때 1.
- 1 이상 증가하게 되면 산 펌프가 작동되면서 octanoic acid와 NH4NO3의 혼합용액이 공급되도록 하였다. 공급 기질 용액의 탄소원/질소원 비 (C/N 비)를 10, 20, 100 (g octanoic acid/g NH4NO3)의 세 가지로 달리하여 C/N 비에 따른 균체 성장과 PHA 합성에 미치는 효과를 관찰하였다.
- 1 이상으로 올라가면 pH 제어용 산 펌프에 octanoic acid와 NH4NO3 혼합기질이 자동으로 공급되도록 하였다. 공급 배지 조성은 탄소원/질소 원비 (C/N 비)를 각각 10, 20, 100 (g octanoic acid/g NH4NO3)으로 변화 시켜 C/N 비에 따른 균체 성장 및 PHA 합성 효과를 고찰하였다. 균일한 배지를 공급하기 위하여 magnetic bar로 공급 배지 용액을 교반 시켰다.
- 균체 성장을 알아보기 위해 발효 도중 소량의 배양액을 취하여 600 run에서의 흡광도를 측정하였다. 균체 농도는 배양액 3 - 5 ml을 원심분리하여 세척한 후 동결건조기에서 24 h 이상 건조시켜 질량을 측정하여 결정하였다.
- 유가식 배양에서의 기질공급방식은 pH-stat 방법이었다. 즉 배양액의 pH가 7.1 이상으로 올라가면 pH 제어용 산 펌프에 octanoic acid와 NH4NO3 혼합기질이 자동으로 공급되도록 하였다. 공급 배지 조성은 탄소원/질소 원비 (C/N 비)를 각각 10, 20, 100 (g octanoic acid/g NH4NO3)으로 변화 시켜 C/N 비에 따른 균체 성장 및 PHA 합성 효과를 고찰하였다.
- 본 연구에서는 질소원중 NH4NO3가 배양액의 pH를 일정하게 유지시키는 효과가 있다는 사실&로부터 질소원으로 NH4NO3를 이용하였다. 즉 탄소원인 octanoic acid가 소모되면서 pH가 설정치보다 0.1 이상 증가하게 되면 산 펌프가 작동되면서 octanoic acid와 NH4NO3의 혼합용액이 공급되도록 하였다. 공급 기질 용액의 탄소원/질소원 비 (C/N 비)를 10, 20, 100 (g octanoic acid/g NH4NO3)의 세 가지로 달리하여 C/N 비에 따른 균체 성장과 PHA 합성에 미치는 효과를 관찰하였다.
- o/eouorans의 경우에도 질소원이 완전 고갈되었을 경우에는 PHA 함량이 30 - 40%에 불과했던 기존의 결과3)를 참고해서 배양 도중 질소원을 탄소원과 함께 공급하는 것이 PHA 함량을 증가시킬 수 있을 것이라고 생각하였다. 탄소원과 질소원이 동시에 자동으로 공급되기 위해 배양액의 pH 변화를 이용하는 새로운 pH-stat 방법을 개발하였다. 배양액의 pH를 감소시키는 요인에는 유기산과 같은 대사산물의 생성이나 질소원으로 암모니아를 이용하는 경우 등이 있다.
대상 데이터
- 만일 (NH4)2SCO4나 NH4C1 등을 질소원으로 사용하게 되면 질소원이 소모됨에 따라 pH가 감소하게 되므로 위의 전략을 따를 수 없다. 본 연구에서는 질소원중 NH4NO3가 배양액의 pH를 일정하게 유지시키는 효과가 있다는 사실&로부터 질소원으로 NH4NO3를 이용하였다. 즉 탄소원인 octanoic acid가 소모되면서 pH가 설정치보다 0.
- 사용한 균주는 P. oleovorans (ATCC 29347)이었다. 종 배양 및 유가식 배양의 초기 배지 조성은 octanoic acid 4 g/L, NH4NO3 1 g/L, KH2PO4 7 g/L, citric acid O.
이론/모형
- 균체 농도는 배양액 3 - 5 ml을 원심분리하여 세척한 후 동결건조기에서 24 h 이상 건조시켜 질량을 측정하여 결정하였다. PHA는 기체크로마토그래피 방법으로 분석하였다. 배양액중 octanoic acid 농도는 Ramsay 등의 방법2)으로 기체크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
- PHA는 기체크로마토그래피 방법으로 분석하였다. 배양액중 octanoic acid 농도는 Ramsay 등의 방법2)으로 기체크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
- 발효조의 교반 속도는 1300 rpm까지 증가시켰다. 유가식 배양에서의 기질공급방식은 pH-stat 방법이었다. 즉 배양액의 pH가 7.
성능/효과
- 5 - 7 배에 달한다.1) MCL-PHAte 더 비싼 기질을 이용하여야 하고, 미생물로부터 합성수율, 균체내 PHA 함량 등이 낮으므로 PHB/V 가격보다도 더 비쌀 것으로 예측된다. 따라서 MCL-PHA의 경우, 현재로서는 범용 플라스틱을 대체하기 보다는 생산단가에 영향을 덜 받는 의료용 재료 또는 특수용도로의 활용이 더 적합할 것으로 생각된다.
- 일반적으로 SCL-PHA를 합성하는 Ralstonia eutropha의 경우 질소원 제한은 PHA 합성을 촉진시키며,4)배양액중 질소원의 완전한 고갈보다는 PHA 합성을 최대로 하는 최적농도가 있음도 보고되었다.3 본 연구에서는 P. o/eouorans의 경우에도 질소원이 완전 고갈되었을 경우에는 PHA 함량이 30 - 40%에 불과했던 기존의 결과3)를 참고해서 배양 도중 질소원을 탄소원과 함께 공급하는 것이 PHA 함량을 증가시킬 수 있을 것이라고 생각하였다. 탄소원과 질소원이 동시에 자동으로 공급되기 위해 배양액의 pH 변화를 이용하는 새로운 pH-stat 방법을 개발하였다.
- oleovorans의 유가식 배양에서 탄소원으로 octanoic acid, 질소원으로 NH4NO3를 이용한 혼합기질을 배양액의 pH 변화에 따라 공급하는 pH-stat 기질공급전략을 개발하였다. 공급기 질의 탄소원/질소원 비 (C/N 비)를 변화시킴으로써 최종 균체 농도, PHA 농도, PHA 함량 등을 변화시킬 수 있었으며, 최대 균체 농도는 C/N 비가 10 (g octanoic acid/g NH4NO3)일 때 65 g/L, 최대 PHA 농도는 C/N 비가 20일 때 41 g/L, 최대 PHA 함량은 C/N 비가 20일 때 75%였으며 최대 PHA 생산성은 C/N 비가 10일 때 1.03 g/Jh 였다.
- oleovorans^- 같이 다양한 구조의 PHA를 합성할 수 있을지는 의문이다. 따라서 본 연구는 side chain에 functional group을 가진 PHA를 합성할 수 있는 P. oleovorans^ 별다른 부대 장치 없이 비교적 간단한 방법으로 고농도, 고함량으로 생산할 수 있다는 점이 장점이라 하겠다.
- 즉 PHA 합성을 최적으로 하는 C/N 비가 있음을 알았다. 본 연구에서 얻은 균체 농도, PHA 농도 및 함량은 기존에 문헌에 보고된 P. o/eouonans를 이용한 결과 중 모두 가장 높은 수치이다. 지금까지 가장 높은 결과는 Dufresne와 Samairf7)이 얻은 47 g/J의 균체와 55%의 PHA 함량이었다.
- 질소원이 많이 공급될수록 균체 성장이 활발하여 최종 균체 농도가 높았고, 최종 PHA 농도나 함량은 C/N 비가 20일 때가 가장 높았다. 즉 PHA 합성을 최적으로 하는 C/N 비가 있음을 알았다. 본 연구에서 얻은 균체 농도, PHA 농도 및 함량은 기존에 문헌에 보고된 P.
- 표 1에 유가식 배양 결과를 정리하였다. 질소원이 많이 공급될수록 균체 성장이 활발하여 최종 균체 농도가 높았고, 최종 PHA 농도나 함량은 C/N 비가 20일 때가 가장 높았다. 즉 PHA 합성을 최적으로 하는 C/N 비가 있음을 알았다.
후속연구
- 1) MCL-PHAte 더 비싼 기질을 이용하여야 하고, 미생물로부터 합성수율, 균체내 PHA 함량 등이 낮으므로 PHB/V 가격보다도 더 비쌀 것으로 예측된다. 따라서 MCL-PHA의 경우, 현재로서는 범용 플라스틱을 대체하기 보다는 생산단가에 영향을 덜 받는 의료용 재료 또는 특수용도로의 활용이 더 적합할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 MCL-PHA의 경제적 생산을 위한 Pseudomonas oleovorans2\ 고농도 유가식 발효공정을 개발하고자 하였 다.
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