To identify and evaluate the dichlorobenzidine(DCB)-DNA adducts in liver cell and bladder epithelial cells by $^{32}$ P-postlabeling and GC/MS-SIM, we orally exposed the dichlorobenzidine (20mg/kh body wt.,/day)to male sprague-dawley rats for 14 days. Two kinds of DCB-DNA adduct were foun...
To identify and evaluate the dichlorobenzidine(DCB)-DNA adducts in liver cell and bladder epithelial cells by $^{32}$ P-postlabeling and GC/MS-SIM, we orally exposed the dichlorobenzidine (20mg/kh body wt.,/day)to male sprague-dawley rats for 14 days. Two kinds of DCB-DNA adduct were found at the same site of thin layer chromatogram of $^{32}$ P-postlabeling method in liver cells and bladder epithelial cells. In liver cells, relative adduct labeling(RAL) $\times$ 10$^{12}$ of DCB-DNA adduct A1 were 34.1$\pm$3.71 and 69.9$\pm$5.02, that of adduct A2 were 74.1$\pm$10.1 and 105.1$\pm$10.1 on 10 and 14 days after treatment, respectively. And in bladder epithelia cells, RAL $\times$ 10$^{12}$ of DCB-DNA adduct A1 were 5.92$\pm$1.60 and 15.9$\pm$1.31, that of adduct A2 were 9,81$\pm$2.81 and 22.8$\pm$1.79 on 10 and 14 days after treatment, respectively. DCB metabolites formed DNA adducts were monoacetyl-dichlorobenzidine(acDCB) and diacety1-dichlorobenzidine(di-acDCB), which was identify by gas chromatography/mass spectrometry-scan ionization mode(GC/MS-SIM), along with hydrolysis, extraction and TFA(trifluoroacetyl anhyride) derivatization with DCB-DNA adducts isolated from live cells and bladder epithelial cells. The base peak of acDCB were 252 and 294 m/z, and that of di-acDCB were 252, 294 and 336 m/z. In conclusion, the exposed DCB formed two kinds of DCB-DNA adduct, the proximate materials of that were acDCB and di-acDCB in liver and bladder epithlial cells. And the above GC/MS-SIM method was found the DCB-DNA adducts could be monitoring by gas chromatography.
To identify and evaluate the dichlorobenzidine(DCB)-DNA adducts in liver cell and bladder epithelial cells by $^{32}$ P-postlabeling and GC/MS-SIM, we orally exposed the dichlorobenzidine (20mg/kh body wt.,/day)to male sprague-dawley rats for 14 days. Two kinds of DCB-DNA adduct were found at the same site of thin layer chromatogram of $^{32}$ P-postlabeling method in liver cells and bladder epithelial cells. In liver cells, relative adduct labeling(RAL) $\times$ 10$^{12}$ of DCB-DNA adduct A1 were 34.1$\pm$3.71 and 69.9$\pm$5.02, that of adduct A2 were 74.1$\pm$10.1 and 105.1$\pm$10.1 on 10 and 14 days after treatment, respectively. And in bladder epithelia cells, RAL $\times$ 10$^{12}$ of DCB-DNA adduct A1 were 5.92$\pm$1.60 and 15.9$\pm$1.31, that of adduct A2 were 9,81$\pm$2.81 and 22.8$\pm$1.79 on 10 and 14 days after treatment, respectively. DCB metabolites formed DNA adducts were monoacetyl-dichlorobenzidine(acDCB) and diacety1-dichlorobenzidine(di-acDCB), which was identify by gas chromatography/mass spectrometry-scan ionization mode(GC/MS-SIM), along with hydrolysis, extraction and TFA(trifluoroacetyl anhyride) derivatization with DCB-DNA adducts isolated from live cells and bladder epithelial cells. The base peak of acDCB were 252 and 294 m/z, and that of di-acDCB were 252, 294 and 336 m/z. In conclusion, the exposed DCB formed two kinds of DCB-DNA adduct, the proximate materials of that were acDCB and di-acDCB in liver and bladder epithlial cells. And the above GC/MS-SIM method was found the DCB-DNA adducts could be monitoring by gas chromatography.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 Talaska 등(1992)이 개발한 효과적인 ^P-postlabeling방법에 의하여 DNA adducts을 분리하여 측정하고, 분리된 DNA adduct를 가수분해에 의하여 디클로 로벤지딘의 대사물질을 추출하여 GC/MS로 디클로로벤지딘의 대사물질을 확인하여 측정하고자 하였다.
제안 방법
투여한 후 4일, 7일, 10일 그리고 14일에 실험동물을 희생시키어 간장을 채취하였고, 방광의 내부표면에서 방광의 상피세포를 채취하였다. 그리고 채취한 시료에서 DNA를 분리한 후에 가수분해하여 DNA adduct를 추출하였다. 추출된 DNA adduct에 [7-32P]aTP로 라벨링하고 TLC로 분리하여 DNA adduct를 측정하여 RAL(relative adduct level)값으로 나타내었다.
추출된 DNA adduct에 [7-32P]aTP로 라벨링하고 TLC로 분리하여 DNA adduct를 측정하여 RAL(relative adduct level)값으로 나타내었다. 또한 DNA adduct에 결합되어 있는 디클로로벤지딘의 대사물질을 GC/MS에 의하여 확인하였다.
DNA adduct는 발암물질에 의한 암 발생을 예방하는데 중요한 생체지표(biomaker)이 다. 본 연구에서 끄P-postlabeling방법 에 의하여 디클로로벤지딘(2 mg/kg body wt./day)에 14일 동안 경구 투여된 흰쥐의 간장 세포와 방광 상피세포에서 DNA adduct를 분리하였다. 본 연구 결과에서 간장 세포와 방광 상피 세포 모두에서 각각 2개의 DNA adduct가 동일한 박막 이온교환 크로마토그래피 fTLC)에서 분리되어 장기에 관계없이 디클로로벤 지딘에 의하여 형성되는 DNA adduct가 두 개 종류임을 증명하였다.
연령이 4주이고, 체중이 180±10g인 40마리의 횐쥐(Female SD)에게 14일 동안 대조군에게는 식염수를, 투여군에게는 디클로로벤지딘(20mg/kg body wt./day)을 경구로 매일 투여하였다. 투여한 후 4일, 7일, 10일 그리고 14일에 실험동물을 희생시키어 간장을 채취하였고, 방광의 내부표면에서 방광의 상피세포를 채취하였다.
그리고 채취한 시료에서 DNA를 분리한 후에 가수분해하여 DNA adduct를 추출하였다. 추출된 DNA adduct에 [7-32P]aTP로 라벨링하고 TLC로 분리하여 DNA adduct를 측정하여 RAL(relative adduct level)값으로 나타내었다. 또한 DNA adduct에 결합되어 있는 디클로로벤지딘의 대사물질을 GC/MS에 의하여 확인하였다.
/day)을 경구로 매일 투여하였다. 투여한 후 4일, 7일, 10일 그리고 14일에 실험동물을 희생시키어 간장을 채취하였고, 방광의 내부표면에서 방광의 상피세포를 채취하였다. 그리고 채취한 시료에서 DNA를 분리한 후에 가수분해하여 DNA adduct를 추출하였다.
성능/효과
본 연구에서 는 GC/MS-SIM에의 하여 디 아세 텔디클로로벤지 딘의 스펙트럼은 252 m/z, 294 m/z 그리고 336 m/z에서 기본피크가 나타났다. 그리고 32p-postiabeling 방법에 의하여 간장과 방광 세포에서 추출한 DNA adduct를 가수분해하여 DNA와 결합하고 있던 디클로 로벤지딘의 대사물질을 추출한 후에 GC/MS-SIM으로 측정하여 표준 스펙트럼의 머므 름시간과 기본피크의 구성을 대조하여 DNA adduct에 결합된 디클로로벤지딘의 대사물질이 모노아세틸디클로로벤지딘과 디아세틸디클로로벤지딘임을 확인하였다.
디클로로벤 지딘은 생체에 폭로되어 간장과 방광세포에 동일하게 두 개의 DNA adduct를 형성하며, 그 DNA adduct를 형성 하고 있는 DCB의 대사물질은 모노아 세 틸디클로로벤지딘과 디아세틸 디클로로벤진딘 임을 확인하였다.
/day)에 14일 동안 경구 투여된 흰쥐의 간장 세포와 방광 상피세포에서 DNA adduct를 분리하였다. 본 연구 결과에서 간장 세포와 방광 상피 세포 모두에서 각각 2개의 DNA adduct가 동일한 박막 이온교환 크로마토그래피 fTLC)에서 분리되어 장기에 관계없이 디클로로벤 지딘에 의하여 형성되는 DNA adduct가 두 개 종류임을 증명하였다. 본 연구에서 디클로로벤지딘(2 mg/kg body wt.
체내에 흡수된 디클로로벤지딘이 간장과 방광 상피세포에서 2개의 DNA adduct를 형성한다는 본 연구의 결과와 디클로로벤지딘이 간장에서 N-아세틸화와 산화 반응에 의 한 N-수산화아미류의 형성에 대한 이론은 DNA와 결합한 디클로로벤지딘의 대사물질이 모노아세 틸디클로로벤지딘과 디아세틸디클로로벤지딘이라고 예측할 수 있다. 본 연구에서 는 GC/MS-SIM에의 하여 디 아세 텔디클로로벤지 딘의 스펙트럼은 252 m/z, 294 m/z 그리고 336 m/z에서 기본피크가 나타났다. 그리고 32p-postiabeling 방법에 의하여 간장과 방광 세포에서 추출한 DNA adduct를 가수분해하여 DNA와 결합하고 있던 디클로 로벤지딘의 대사물질을 추출한 후에 GC/MS-SIM으로 측정하여 표준 스펙트럼의 머므 름시간과 기본피크의 구성을 대조하여 DNA adduct에 결합된 디클로로벤지딘의 대사물질이 모노아세틸디클로로벤지딘과 디아세틸디클로로벤지딘임을 확인하였다.
본 연구 결과에서 간장 세포와 방광 상피 세포 모두에서 각각 2개의 DNA adduct가 동일한 박막 이온교환 크로마토그래피 fTLC)에서 분리되어 장기에 관계없이 디클로로벤 지딘에 의하여 형성되는 DNA adduct가 두 개 종류임을 증명하였다. 본 연구에서 디클로로벤지딘(2 mg/kg body wt./day)의 폭로에 의하여 형성된 두 종류 DNA adduct(Al과 A2)의 RALXlO”값이 간장에서는 4일에는 각각 0.75±1.43 와 1.32土1.38이었으나 7일째부터 크게 증가하여 14일에는 각각 69.9±5.02과 105 ±10.04로 매우 높게 나타났고, 방광 상피세포에 형성된 2개의 DNA adduc(Al과 A2)의 RALxlO^값도 4일에 각각 1.18土0.85오} 3.94± 1.56이었으나 14일에는 각각 9.81 ±2.81 과 22.79土 1.79로 증가하였다. 또한 DNA adducts(Al과 A2)의 RAL값이 방광 상피 세포에 비해 간장 세포에 서 각각 5.
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