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제안 방법
- UV를 이용한 변이유노는 irradiation source (Spectroline model ENF-260c 115 V, 60 Hz, 60amps, USA) 로부터 6 cm 거리를 두어 254 nm 파장 하에서 실시하였다. 1 -N-methyl-N, -nitro-N-nitrosoguanidine (NTG, Sigma)를 이용한 변이유도는 최종 농도 0.4%가 되도록 NTG-8- 처리한 후 이를 시간별로 YPD agar 배지 (glucose 20 g/L, peptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L)에서 키운 후 YMGL agar 배지 (glycerol 30 g/L, yeast extract 3 g/L, malt extract i g/L, peptone 1 g/L)에 replica plating을 하였다. Screening 방법으로는 지방산 생성능이 우수한 균주를 선별하기 위하여 70% ethyl alcohol 100 曲에 sudan black B 0.
- 4%가 되도록 NTG-8- 처리한 후 이를 시간별로 YPD agar 배지 (glucose 20 g/L, peptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L)에서 키운 후 YMGL agar 배지 (glycerol 30 g/L, yeast extract 3 g/L, malt extract i g/L, peptone 1 g/L)에 replica plating을 하였다. Screening 방법으로는 지방산 생성능이 우수한 균주를 선별하기 위하여 70% ethyl alcohol 100 曲에 sudan black B 0.2 g를 녹여 만든 sudan Black B 염색액 일정량을 각각의 콜로니에 떨어뜨려 염색시킨 후 진한 암청색 침전물이 상대적으로 많은 콜로니를 선별하였다. 선별한 변이균주들을 250 mH baffled flask (working volume : 30 皿)을 이용하여 TAPS 발효배지 (glycerol 120 g/L, yeast extract 2 g/L, KNO3 3 g/L, citrate 1 g/L, (NHD2SO3 1.
- Sodium acetate를 TAPS 발효배지 성분 중 citrate 1 g/L 대신 1~4 g/L 범위로 침가하여 TAPS 발효배지 30 I北를 250 ml! baffled flask로 교반속도 160 으로 7일간 진탕배양을 하였다. 실험결과 (table 3)에서 sodium acetate를 첨가한 경우가 첨가하지 않은 경우보다 TAPS 생성이 약 68~100% 증가하였으며, 특히 3 g/L의 sodium acetate를 첨가한 경우에서 6.
- 또한 사람의 피부와 동일한 D-erythro (2S, 3R) 구조를 갖고 있어 사람의 피부와 친화성이 있는 ceramide를 합성하는 전구체로 사용될 수 있다” 본 연구에서는 TAPS 생산능이 우수한 균주를 찾기 위해 Pichia ciferrii ATCC 14091의 포자를 물리, 화학적인 방법으로 돌연변이를 유도하여 Sudan Black B 염색법으로 먼저 지방산 생산이 우수한 변이균주를 선별한 후에 콜로니 형태 관찰과 같은 간단한 방법을 통하여 최종적으로 우수 변이균주를 선별하였匸]■. 또한 선별한 변이균주를 이용하여 TAPS 생산의 전구체인 acetyl-CoA를 제공하는 sodium acetate에 대한 영향을 검토하였다.
- 본 인구에서는 주식회사 두산에서 분양 받은 Pichia c泥厂ATCC 14091을 malt extract 이ant agar (5 % malt extract, 2 % agar)에서 25℃ 배양조건에서 2주간 배양하이 hat-shape spore 를 얻었으며, lyticase (Sigma, 800 니 nit/mg) 을 spore Suspension 1 ml 당 100 unit씨 처리하여 cell wall을 degradation 시킨 후 55℃ 조건에서 heat shock을 2분 동안 처리하여 single spore를 읻었다. UV를 이용한 변이유노는 irradiation source (Spectroline model ENF-260c 115 V, 60 Hz, 60amps, USA) 로부터 6 cm 거리를 두어 254 nm 파장 하에서 실시하였다.
- 2 g를 녹여 만든 sudan Black B 염색액 일정량을 각각의 콜로니에 떨어뜨려 염색시킨 후 진한 암청색 침전물이 상대적으로 많은 콜로니를 선별하였다. 선별한 변이균주들을 250 mH baffled flask (working volume : 30 皿)을 이용하여 TAPS 발효배지 (glycerol 120 g/L, yeast extract 2 g/L, KNO3 3 g/L, citrate 1 g/L, (NHD2SO3 1.5 g/L, MgSO」 7H>O g/L, CaCl-2 2 g/L, CSP 1, 5 g/L)에서 배양하여 TAPS 생성이 우수한 균주를 선별하였匸h TAPS의 분리 및 분석은 Chloroform과 methanol을 2:1 비율로 혼합한 용액을 배양이 끝난 TAPS 배양액 부피의 4배가 되도록 가하여 추출한 후 HPLC (Waters 410, USA)와 ELSD detector (Alltech ELSD 2000, USA)를 이용하여 정량분석을 하였다. Hexane과 Acetone을 1:1로 혼합한 용매를 이동상으로 사용하였고 유속은 1.
대상 데이터
- 5 g/L, MgSO」 7H>O g/L, CaCl-2 2 g/L, CSP 1, 5 g/L)에서 배양하여 TAPS 생성이 우수한 균주를 선별하였匸h TAPS의 분리 및 분석은 Chloroform과 methanol을 2:1 비율로 혼합한 용액을 배양이 끝난 TAPS 배양액 부피의 4배가 되도록 가하여 추출한 후 HPLC (Waters 410, USA)와 ELSD detector (Alltech ELSD 2000, USA)를 이용하여 정량분석을 하였다. Hexane과 Acetone을 1:1로 혼합한 용매를 이동상으로 사용하였고 유속은 1.0 mL/min으로 하였다. 분석에 사용한 columne YMC-pack SIL (YMC, Japan)을 사용하였으며 tube 온도는 50℃, gas flow (N2)는 1.
- 선별한 변이균주 UV-P17, UV-P63과 wild type-P31 을 glycerol 120g인 TAPS 발효 배지에서 배양한 결과를 table 1에 나타내었다. 실험결과에서 TAPS 생산이 약간 증가하였으며 TAPS 생산의 최적 pH가 8인 변이균주 UV-P63을 선정하였다.
이론/모형
- Sudan Black B 염색법을 통해 중성지방산 생성이 우수한 균주를 선별少하였다. 선별한 변이균주 UV-P17, UV-P63과 wild type-P31 을 glycerol 120g인 TAPS 발효 배지에서 배양한 결과를 table 1에 나타내었다.
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