Leuconostoc mesenteroides B-512FMCM, 742CB3, 1299C의 dextransucrase들의 glycosyl기 전이 특성을 수용체 반응과 transglycosylation반응을 통해 확인하였다. 수용체 반응의 경우 10% sucrose에 수용체로 4% maltose를 첨가하여 반응시켰고 transglycosylation반응은 다른 크기, 다른 농도 그리고 다른 종류의 가지 결합의 dextran 을 합성하는 효소들을 이용하여 수행하였다. 각각의 효소들은 maltose를 이용한 수용체 반응에서 유사한 종류의 수용체 산물들을 합성한 것에 비해 세 dextransucrase들 (512FMCM, 742CB3, 1299C) 을 일정 비율로 혼합하여 maltose를 이용한 수용체 반응 결과 512FMCM 효소의 활성 비율을 줄이고 742CB3, 1299C 효소의 활성 비율을 증가시켰을 경우에는 ${\alpha}-1{\rightarrow}$3 의 가지결합이 많은 dextran 을 합성하였다. 또한, 세 가지 다른 구조의 dextran(T40, 742CB, B1299)에 100mM maltose을 수용체로 첨가해 각각의 dextransucrase(512FMCM, 742CB3, 1299C)와 transgly cosylation을 수행한 결과 1299C 효소가 세 종류의 dextran(T40, 742CB, B1299) 에 모두 가지 결합이 많은 dextran을 합성함을 확인하였다. 또한 ${\alpha}-1{\rightarrow}$6 결합으로 주로 이루어진 2%, 5% dextran(T10, T40, T7O, T500, T2000)에 dextransucrase(512FMCM, 742CB3, 1299C)를 반응시켜 기존의 dextran 보다 가지 결합이 더 많이 형성된 transglycosylation 산물을 합성하였다. 이때 maltose를 첨가했을 경우 이 수용 체에 의해 많은 ${\alpha}-1{\rightarrow}$6 가지 결합의 dextran 을 합성함을 확인하였다.
Leuconostoc mesenteroides B-512FMCM, 742CB3, 1299C의 dextransucrase들의 glycosyl기 전이 특성을 수용체 반응과 transglycosylation반응을 통해 확인하였다. 수용체 반응의 경우 10% sucrose에 수용체로 4% maltose를 첨가하여 반응시켰고 transglycosylation반응은 다른 크기, 다른 농도 그리고 다른 종류의 가지 결합의 dextran 을 합성하는 효소들을 이용하여 수행하였다. 각각의 효소들은 maltose를 이용한 수용체 반응에서 유사한 종류의 수용체 산물들을 합성한 것에 비해 세 dextransucrase들 (512FMCM, 742CB3, 1299C) 을 일정 비율로 혼합하여 maltose를 이용한 수용체 반응 결과 512FMCM 효소의 활성 비율을 줄이고 742CB3, 1299C 효소의 활성 비율을 증가시켰을 경우에는 ${\alpha}-1{\rightarrow}$3 의 가지결합이 많은 dextran 을 합성하였다. 또한, 세 가지 다른 구조의 dextran(T40, 742CB, B1299)에 100mM maltose을 수용체로 첨가해 각각의 dextransucrase(512FMCM, 742CB3, 1299C)와 transgly cosylation을 수행한 결과 1299C 효소가 세 종류의 dextran(T40, 742CB, B1299) 에 모두 가지 결합이 많은 dextran을 합성함을 확인하였다. 또한 ${\alpha}-1{\rightarrow}$6 결합으로 주로 이루어진 2%, 5% dextran(T10, T40, T7O, T500, T2000)에 dextransucrase(512FMCM, 742CB3, 1299C)를 반응시켜 기존의 dextran 보다 가지 결합이 더 많이 형성된 transglycosylation 산물을 합성하였다. 이때 maltose를 첨가했을 경우 이 수용 체에 의해 많은 ${\alpha}-1{\rightarrow}$6 가지 결합의 dextran 을 합성함을 확인하였다.
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제안 방법
Dextran에 maltose를 첨가한 transglycosylation 반응 : 0.1%, 2%, 5%의 dextran (T10, T40, T70, T500, T2000)을 준비해 4% maltose를 수용체로 첨가하여 dextran sucrase (512FMCM, 742CB3, 1299C)와 28℃ 에서 transglycosylation 반웅을 한 후 67% 에탄올로 침전된 산물을 dextranase 처리하여 TLC로 확인하였다. 사용한 전개 용매는 nitromethane : 1~propanol : water■-2:5:3(v/v/v)이었다.
Dextran을 이용한 transglycosylation: 0.1%, 2%, 5%의 dextran (T10, T40, T70, T500, T2000X 준曰]충H dextransucrase (512FMCM, 742CB3, 1299C) 와 28℃에서 transglycosylation 반응을 한 후 67% ethanol로 침전된 산물을 dextrana se 처리하여 TLC로 확인하였다. 사용한 전개 용매는 nitromethane : 1-propanol : water-2:5:3(v/v/v)이 었다.
다른 dextransucrase를 각각의 비율로 흔합한 수용체 반응 : 10% sucrose를 이용하여 세 효소(512FMCM, 742CB3, 12990 각각의 활성 비율을 달리하여 혼합하고 4% maltose를 수용체로 첨가하여 총 반웅부피 10ml, 총 효소 활성을 10U으로 조절한 뒤 28℃에서 반응시키고 67%의 ethanol을 넣어 침전시킨 dextran을 dextranase 로 처리하여 분해되어 나온 산물을 전개 용매로 nitromethane : 1-propanol : water-2:5:1.5(v/v/v)를 사용하여 TLC로 확인하였다.
05M의 NaOH로 정지 시 켰다. 반응 후 생산된 fructose의 양은 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였으며 사용한 전개 용매는 acetonitrile : water-85 : 15 (v/v)를 사용하였다.
현재까지 이에 대한 연구결과는 구체적으로 보고된바 없으며 다른 구조의 dextran을 합성하는 효소들의 복합 작용에 의해 합성되는 dextran의 구조차이에 대한 연구결과도 구체적으로 없다. 본 연구에서는 여러가지 효소들의 복합 작용에 의해 합성되는 dextran의 가지 결합 정도를 확인하고 transglycosylation 반응을 수용체를 넣거나 넣어 주지 않은 조건에서 수행하여 그 생산물의 가지 결합 정도를 확인하였다. Leuconostoc mesenteroides B-742 균주가 만드는 Fraction L dextrane 38% alcohol에 침전되고 약 14%의 a-1 -4가지 결합을 갖고 있으며, fraction S dextrane 44%의 alcohol에 침전되며, 모든 glucose unit에 한 개의 glucose가 aT—3가지 결합을 가지고 있다(전체 가지 결합 정도는 50%).
세 종류의 dextran을 이용한 transglycosylation 반응 : 2%의 세 종류의 dextran (T40, 742CB, B1299)에 lOOmM maltose를 수용체로 첨가하고 각각의 세 dextran sucrase(512FMCM, 742CB3, 1299C)를 28℃에서 반응한 후 산물을 전개용매로 nitro methane : 1-propanol : water-2:5:1.5(v/v/v)를 사용하여 TLC로 확인하였다.
대상 데이터
배양조건 : 본 연구에 사용된 Leuconostoc mesenteroides B-512FMCM, 742CB3, 1299C는 28C, pH 5.2의 조건에서 2%(w/v) glucose가 포함된 LWG배지를 이용하여 배 양하였다. LWG배지 의 조성은 yeast extract 5g//, peptone 5g/£, K2HPO4 5g/ /, 1% mineral solution (0.
1%, 2%, 5%의 dextran (T10, T40, T70, T500, T2000X 준曰]충H dextransucrase (512FMCM, 742CB3, 1299C) 와 28℃에서 transglycosylation 반응을 한 후 67% ethanol로 침전된 산물을 dextrana se 처리하여 TLC로 확인하였다. 사용한 전개 용매는 nitromethane : 1-propanol : water-2:5:3(v/v/v)이 었다.
성능/효과
> 각각의 효소들이 transglycosylation 반응 후 생산하는 올리고당의 종류는 달랐으며 glucose의 donor로서 사용되는 dextran의 종류에 따라서도 다른 반응 산물을 생산함을 확인하였다.
> 복합 효소를 이용한 반응에서 얻어진 산물이 가지 결합을 더 많이 갖고 있는 dextran임을 확인하였다.
후속연구
현재까지 알려진 dextransucrase 유전자들에 의해 합성된 효소들 증 자체적으로 모균의 효소만큼 가지 결합을 갖는 dextran을 합성하는 효소들의 유전자는 발표되지 않았다. 그러나 유전자의 종류에 따라가지 결합된 dextran의 정도는 달라 효소 자체의 특성이 어느 정도 가지 결합 형성에 관여하지만 dextran이 수용체로 작용할 것이라는 생각도 좀 더 자세히 검토되어야 한다. 현재까지 이에 대한 연구결과는 구체적으로 보고된바 없으며 다른 구조의 dextran을 합성하는 효소들의 복합 작용에 의해 합성되는 dextran의 구조차이에 대한 연구결과도 구체적으로 없다.
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