각종 환경스트레스에 의해 생체 내에서 과량으로 생성되는 독성의 활성산소종 (ROS)은 산화스트레스를 유발시켜 식물의 질병, 노화 및 세포사멸을 촉진시킨다. 연구팀은 21세기 당면한 지구규모의 환경, 식량 및 보건문제 해결에 기여할 수 있는 기발기술 (plateform technology)를 개발하기 위하여 식물 세포의 항산화기구 규명, 산화스트레스 유도성 항산화효소 유전자 개발, 스트레스 내성식물 개발에 관한 연구를 수행하고 있다. 여기에서는 항산화효소 유전자를 이용한 산업용식물체 개발에 관한 연구팀의 최근 연구결과를 중심으로 소개하였다. SOD와 APX 유전자를 엽록체에 동시에 발현시킨 담배식물체는 MV, 건조 등 여러 스트레스에 대한 내성을 나타내어, 복합 스트레스내성 농작물개발에 활용이 기대된다. 인체 DHAR 유전자를 엽록체에 도입시킨 담배식물체는 정상적으로 DHAR 유전자를 발현시켰으며, MV 등 여러 스트레스에 대한 내성을 나타내었다. 피부 노화방지 등에 관여하여 ROS를 제거하는 SOD를 과실에 과발현시킨 형질전환오이를 성공적으로 개발하여, SOD 오이는 기능성화장품의 용도로 제품개발이 기대된다. 또한 고구마에서 산화스트레스에 특이적으로 발현하는 POD (SWA2) promoter를 개발하였다. SWPAS2 Pormoter는 스트레스내성 및 의료용 단밸질 등 고부가가치 생리활성물질을 생산할 수 있는 산업용 형질전환 식물체 및 배양세포주 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
각종 환경스트레스에 의해 생체 내에서 과량으로 생성되는 독성의 활성산소종 (ROS)은 산화스트레스를 유발시켜 식물의 질병, 노화 및 세포사멸을 촉진시킨다. 연구팀은 21세기 당면한 지구규모의 환경, 식량 및 보건문제 해결에 기여할 수 있는 기발기술 (plateform technology)를 개발하기 위하여 식물 세포의 항산화기구 규명, 산화스트레스 유도성 항산화효소 유전자 개발, 스트레스 내성식물 개발에 관한 연구를 수행하고 있다. 여기에서는 항산화효소 유전자를 이용한 산업용식물체 개발에 관한 연구팀의 최근 연구결과를 중심으로 소개하였다. SOD와 APX 유전자를 엽록체에 동시에 발현시킨 담배식물체는 MV, 건조 등 여러 스트레스에 대한 내성을 나타내어, 복합 스트레스내성 농작물개발에 활용이 기대된다. 인체 DHAR 유전자를 엽록체에 도입시킨 담배식물체는 정상적으로 DHAR 유전자를 발현시켰으며, MV 등 여러 스트레스에 대한 내성을 나타내었다. 피부 노화방지 등에 관여하여 ROS를 제거하는 SOD를 과실에 과발현시킨 형질전환오이를 성공적으로 개발하여, SOD 오이는 기능성화장품의 용도로 제품개발이 기대된다. 또한 고구마에서 산화스트레스에 특이적으로 발현하는 POD (SWA2) promoter를 개발하였다. SWPAS2 Pormoter는 스트레스내성 및 의료용 단밸질 등 고부가가치 생리활성물질을 생산할 수 있는 산업용 형질전환 식물체 및 배양세포주 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Oxidative stress derived from reactive oxygen species (ROS) is one of the major damaging factors in plants exposed to environmental stress. In order to develop the platform technology to solve the global food and environmental problems in the 21st century, we focus on the understanding of the antiox...
Oxidative stress derived from reactive oxygen species (ROS) is one of the major damaging factors in plants exposed to environmental stress. In order to develop the platform technology to solve the global food and environmental problems in the 21st century, we focus on the understanding of the antioxidative mechanism in plant cells, the development of oxidative stress-inducible antioxidant genes, and the development of transgenic plants with enhanced tolerance to stress. In this report, we describe our recent results on industrial transgenic plants by the gene manipulation of antioxidant enzymes. Transgenic tobacco plants expressing both superoxide dismutase (SOD) and ascorbate peroxidase (APX) in chloroplasts were developed and were evaluated their protection effects against stresses, suggesting that simultaneous overexpression of both SOD and APX in chloroplasts has synergistic effects to overcome the oxidative stress under unfavorable environments. Transgenic tobacco plants expressing a human dehydroascorbate reductase gene in chloroplasts were showed the protection against the oxidative stress in plants. Transgenic cucumber plants expressing high level of SOD in fruits were successfully generated to use the functional cosmetic purpose as a plant bioreactor. In addition, we developed a strong oxidative stress-inducible peroxidase promoter, SWPA2 from sweetpotato (Ipomoea batatas). We anticipate that SWPA2 promoter will be biotechnologically useful for the development of transgenic plants with enhanced tolerance to environmental stress and particularly transgenic cell lines engineered to produce key pharmaceutical proteins.
Oxidative stress derived from reactive oxygen species (ROS) is one of the major damaging factors in plants exposed to environmental stress. In order to develop the platform technology to solve the global food and environmental problems in the 21st century, we focus on the understanding of the antioxidative mechanism in plant cells, the development of oxidative stress-inducible antioxidant genes, and the development of transgenic plants with enhanced tolerance to stress. In this report, we describe our recent results on industrial transgenic plants by the gene manipulation of antioxidant enzymes. Transgenic tobacco plants expressing both superoxide dismutase (SOD) and ascorbate peroxidase (APX) in chloroplasts were developed and were evaluated their protection effects against stresses, suggesting that simultaneous overexpression of both SOD and APX in chloroplasts has synergistic effects to overcome the oxidative stress under unfavorable environments. Transgenic tobacco plants expressing a human dehydroascorbate reductase gene in chloroplasts were showed the protection against the oxidative stress in plants. Transgenic cucumber plants expressing high level of SOD in fruits were successfully generated to use the functional cosmetic purpose as a plant bioreactor. In addition, we developed a strong oxidative stress-inducible peroxidase promoter, SWPA2 from sweetpotato (Ipomoea batatas). We anticipate that SWPA2 promoter will be biotechnologically useful for the development of transgenic plants with enhanced tolerance to environmental stress and particularly transgenic cell lines engineered to produce key pharmaceutical proteins.
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문제 정의
아울러 고구마에서 분리한 산화스트레스 유도성 POD promoter에 대한 특성 및 산업적 활용에 대하여 소개한다.
여기에서는 식물의 항산화기구에 대해 엽록체 항산화기구, 배양세포의 항산화기구로 나누어 간단히 소개하고 항산화 효소 유전자를 이용한 엽록체 항산화기구 조절에 의한 스트레스내성 식물 개발과 SOD를 과실에 도입한 신기능성 오이 식물체 개발에 관한 연구팀의 최근 연구결과를 소개한다. 아울러 고구마에서 분리한 산화스트레스 유도성 POD promoter에 대한 특성 및 산업적 활용에 대하여 소개한다.
연구팀은 21세기 당면한 지구규모의 환경, 식량 및 보건문제 해결에 기여할 수 있는 기반기술 (plateform technology)를 개발하기 위하여 식물세포의 항산화기구 규명, 산화스트레스 유도성 항산화효소 유전자 개발, 스트레스 내성식물 개발에 관한 연구를 수행하고 있다. 여기에서는 항산화효소 유전자를 이용한 산업용식물체 개발에 관한 연구팀의 최근 연구결과를 중심으로 소개하였다. SOD와 APX 유전자를 엽록체에 동시에 발현시킨 담배 식물체는 MV, 건조 등 여러 스트레스에 대한 내성을 나타내어, 복합스트레스내성 농작물개발에 활용이 기대된다.
제안 방법
Transgenic plant lines that expressed combinations of three transgenes were used. CuZnSOD=chloroplastic CuZn SOD, Mn chloroplast-targeted MnSOD, APX=chloroplast-targeted cytosolic APX, CA=CuZnSOD-expressing plants retransformed with APX, AM=APX-expressing plants retransformed with chloroplast-targeted MnSOD, CMA and AMC=offspring from reciprocal crosses between CA plants and AM plants that express Cu/Zn SOD, chloroplast targeted MnSOD and chloroplast-targeted APX. Data are means±SE of three replicates.
담배 (Nicotiana tabacum cv. Xanthi)에 SOD와 APX를 단독 또는 복수로 도입한 7종의 형질전환체 (T2 세대)를 개발하여 스트레스 내성특성을 비형질전환식물체 (NT식물체, 또는 Xanthi)와 비교하였다. 형질전환식물체는 완두에서 분리한 SOD와 APX를 CaMV 35S 프로모터를 사용하여 엽록체에 target시킨 것으로 1) CuZnSOD를 도입한 형질전환체 (CuZn 식물체, Sen Gupta et al.
피부 노화방지 등에 관여하여 ROS를 제거하는 SOD를 과실에 과발현시킨 형질전환오이를 성공적으로 개발하여, SOD 오이는 기능성화장품의 용도로 제품개발이 기대된다. 또한 고구마에서 산화스트레스에 특이적으로 발현하는 POD (SWPA2) promoter를 개발하였다. SWPA2 promoter는 스트레스내성 및 의료용 단백질 등 고부가가치 생리활성물질을 생산할 수 있는 산업용 형질전환 식물체 및 배양세포주 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
1999). 배양세포에 강하게 발현하며, 정상적인 식물체에는 발현하지 않지만 산화스트레스에서 식물체에서 강하게 유도되는 swpa2 cDNA를 probe로 사용하여 genomic clone(SWPA2)를 분리하였다(Kim et al. 2002).
연구팀은 배양세포가 높은 산화스트레스에서 배양되고 있을 것임에 착안하여 다양한 식물종에서 유도한 100여 종의 배양세포를 대상으로 SOD, POD, CAT 등의 항산화효소 활성과 AsA, glutathione 등의 저분자 항산화활성을 조사하였다. 그 결과, 식물배양세포의 평균 SOD 활성은 식물체에 비하여 수백배 높았으며, POD 활성도 매우 높았으나 (Kim et al.
카사바 배양세포에서 분리한 cytosolic CuZnSOD (mSODl)(Lee et al. 1999)을 오이 과실에서 발현시키기 위하여 오이의 과실우세 발현 프로모터인 ascorbate oxidase promoter (ASOp) (Yoshida et al. 1994)를 이용하여 ASOp::mSODl/pGPTV-Bar형질전환 벡터를 제작하였다. 기관발생 및 체세포배발생에 의한 오이의 재분화는 연구팀에 의해 확립되었다 (Kim et al.
하지만 잎의 SOD 활성은 형질전환에 관계없이 일정하게 유지되었다. 형질전환 오이의 열매의 SOD isoenzyme 패 턴(활성)을 native gel 방법으로 조사하여, 정상식 물에서는 관찰되지 않은 새로이 발현되는 CuZnSOD isoenzyme 밴드를 확인하였다 (Lee et al. 2002).
대상 데이터
1998, 2000). 해동백다다기 오이종자를 광발아시킨 후 발아 5일된 유식물체의 자엽절편체를 형질전환에 사용하였다. ASOp::mSODl/pGPTV-Bar를 가진 Agrobacteria를 자엽절편체와 공동배양하여 최종적으로 형질전환체를 얻었다(Lee et al.
성능/효과
(Figure 5). 50 μM MV를 처리하였을 때 NT식물체는 62%의 피해를 나타내었으며 CuZn식물체와 Mn식물체는 비슷한 피해를 나타내었고 APX식물체는 40%의 피해를 보인 반면, SOD와 APX를 동시에 발현된 식물체에서는 5~12%의 피해를 나타내었다. 이상으로서 SOD와 APX를 동시에 엽록체에 발현시킨 식물체의 잎은 MV에 의한 산화스트레스로부터 빠르게 회복되는 것을 알 수 있었다 또한 SOD와 APX를 동시에 엽록체에 과발현시킨 식물체는 중금속, 저온, hypoxia, 염류 및 건조 스트레스에 대해 내성을 나타내었다(Jeong 2001).
2002b), 6) CA식물체를 모본으로 하여 AM식물체와 교잡한 형질전환식물체 (CMA식물체, Kwon et al. 2002b), 7) AM식물체를 모본으로 하여 CA식물체와 교잡한 형질전환식물체(AMC식물체, Kwon et al. 2002b)의 7종이다.
나타내었다. AMC식물체와 CMA식물체는 2 μM MV 처리 후 24시간에 NT식물체 (Xanthi)에 비해 각각 82%와 47%의 세포막손상의 보호 효과를 나타내었다. 세 종류의 항산화효소가 도입된 CMA식물체와 AMC식물체가 가장 MV에 대한 보호 효과가 좋았으며, 두 종류의 항산화효소가 도입 된 CA식물체와 AM식물체도 높은 보호효과를 나타내었다 (Kwon et al.
2002). SWPA2 promoter로부터 5개의 deletion mutant를 제작하고 GUS 유전자에 연결하여 담배 BY-2 세포를 이용한 transient assay 결과, 1314 bp deletion promoter는 CaMV 35S promoter의 활성에 비해 약 30배 높은 활성을 나타내었다 (Figure 3). 반면 다른 deletion mutant는 CaMV 35S promoter와 비슷한 활성을 나타내었다.
1999). 결론적으로 식물 배양세포는 유용 항산화효소의 대량생산 및 항산화기구 해석에 좋은 소재임이 시사되었다.
2000). 따라서, 배양세포는 높은 산화스트레스 조건에서 배양되고 이를 극복하기 위하여 식물체보다 매우 높은 항산화효소를 합성하고 있음을 확인할 수 있었다. AsA 함량이 낮은 식물배양세포는 AsA의 생합성연구에 적합한 것을 확인할 수 있었다 (Ahn et al.
(Figure4). 또한 형질전환 담배식물체에서 유도한 형질전환 배양세포에서 특히 강하게 발현됨이 확인되었다. 1824 bp promoter는 배양시기에 관계없이 CaMV 35S promoter에 비해 3~4배 높은 활성을 나타내었으며, 1314bp promoter는 대수증식기 후반부터 높은 GUS 활성을 나타내어 CaMV 35S promoter에 비해 7~8배 높았다 (Kim 2000).
2002). 형질전환 식물체의 열매에서 전체 SOD 활성도 비형질전환 오이열매보다 3배 이상 높게 나타났다. 하지만 잎의 SOD 활성은 형질전환에 관계없이 일정하게 유지되었다.
형질전환 오이식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 Southern 분석을 실시한 결과 2개체는 1copy씩, 1개체는 2copy가 도입되었음을 알 수 있었다. 이때 사용한 probe는 카사바 mSODl cDNA의 3'-UTR 부위 (특이 유전자 부위)를 PCR로 합성 (260 bp)하여 이용하였다.
형질전환식물체의 잎절편체 (leaf disc)와 식물체를 사용하여 MV에 대한 내성을 조사한 결과 SOD와 APX를 엽록체에 동시에 발현시킨 식물체가 MV에 강한 내성을 나타내었다. AMC식물체와 CMA식물체는 2 μM MV 처리 후 24시간에 NT식물체 (Xanthi)에 비해 각각 82%와 47%의 세포막손상의 보호 효과를 나타내었다.
후속연구
또한 고구마에서 산화스트레스에 특이적으로 발현하는 POD (SWPA2) promoter를 개발하였다. SWPA2 promoter는 스트레스내성 및 의료용 단백질 등 고부가가치 생리활성물질을 생산할 수 있는 산업용 형질전환 식물체 및 배양세포주 개발에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
1999). 따라서 SWFA2 promoter는 각종 의료용 단백질을 포함하여 고부가가치 유용물질을 생산하는 산업용 식물세포주 개발에 활용이 기대된다. 현재 스트레스 관점에서 SWPA2 promoter의 특성을 규명중이며, SWPA2 promoter는 환경스트레스 내성식물 및 형질전환 식물배양세포에서 유용물질 생산 등에 이용될 수 있을 것으로 기대되며 이에 대한 관련 실험들이 진행중이다.
따라서, 고구마를 포함한 식물체는 수십 개의 POD 유전자가 존재할 것이 강하게 시사되었으나, 아직 각각 POD 유전자의 생리적인 기능은 거의 모르는 실정이다. 연구팀에서는 스트레스 및 생장과 분화라는 관점에서 각각의 POD 유전자의 기능을 규명하기 위하여 고구마에서 전체 POD 유전자를 분리하는 연구가 진행 중이다.
1997). 특히 SOD와 POD의 고생산 세포주로 카사바 (Manihot esculenta)와 고구마(Ipomoea batatas) 배양세포를 선발하였으며, 이들 세포주를 이용하여 항산화효소 유전자의 분리, 기능연구 및 생명공학제품 개발에 활용하고 있다. (Huh et al.
인체 DHAR 유전자를 엽록체에 도입시킨 담배식물체는 정상적으로 DHAR 유전자를 발현시켰으며, MV 등 여러 스트레스에 대한 내성을 나타내었다. 피부 노화방지 등에 관여하여 ROS를 제거하는 SOD를 과실에 과발현시킨 형질전환오이를 성공적으로 개발하여, SOD 오이는 기능성화장품의 용도로 제품개발이 기대된다. 또한 고구마에서 산화스트레스에 특이적으로 발현하는 POD (SWPA2) promoter를 개발하였다.
따라서 SWFA2 promoter는 각종 의료용 단백질을 포함하여 고부가가치 유용물질을 생산하는 산업용 식물세포주 개발에 활용이 기대된다. 현재 스트레스 관점에서 SWPA2 promoter의 특성을 규명중이며, SWPA2 promoter는 환경스트레스 내성식물 및 형질전환 식물배양세포에서 유용물질 생산 등에 이용될 수 있을 것으로 기대되며 이에 대한 관련 실험들이 진행중이다.
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