[논문]DNA칩을 이용한 SNP의 검출

최용성; 문종대; 이경섭

문제 정의

전극상에는 여러가지 유전자를 공유결합에 의하여 고정화하고, 복수의 유전자를 동시에 검출하였다. 그리고, 최종적으로 제작된 DNA칩을 이용하여, 신속 및 간편한 임상유천자검출에 웅용하는 것을 목적으로 하였다.
따라서, 본 논문에서는 형광검출형 DNA칩과 비교하여 간편성, 휴대성, 캐발코스트의 면에서 우수한 미소전극어레이형 DNA칩을 개발하는 것을 목적으로 하였다. 이를 위하여 고집적형 바이오센서의 제작에 필요불가결한미세가공기술에 의하여 복수의 미소전극을 병열로 배치시킨 DMA칩을 제작하였다.
본 논문에서는 간편성, 휴대성, 개발 비용의 면에서 우수한 미소전극 어레이 형 DNA칩을 개발하는 것을 목적으로 하여, 다음과 같은 결과를 얻었다.
본 논문에서는 바이러스성 질환을 검출하기 위한 DNA칩을 개발하는 것을 최종 목적으로 하고 있으므로, 바이러스 유전자에 특유한 염기배열을 사용하였다. 본 논문에서 piobe DNA (HIV SK38: 5, -ATTTCTCCTACTgggATAggTggATTAT-3, t HIV SK39: 5'-gCATTCTggACATAAgACAAgg ACCAAA - 3') 및 target DNA (target DNA: 5'~C CCCCCCTCCCgggAgAgCCA TAgTTggT-3', 1 mismatched DNA: 5'-CCCCCCCTCCCgggAAAgCCATAgTTgg TT') 이다.
미소전극의 면적은 200x200#이며, 32개의 전극을 병렬시켰다. 본 논문에서는 복수의 유전자를 동시에 검출하기 위하여, 리드선을 각 커넥터에 납땜하여 접착하는 복잡한 공정을 생략하고, 간단히 전기 화학측정을 할 수 있는 카트리지형 DNA칩을 설계하였다. 보통은 기판으로서 베이크판과 같은 수지를 사용하지만, 실제 제작한 결과, 수지 표면이 약간의 요철이 있으므로, 리드선 부분에 단선이 많이 있었다.
probe DNA에 상보적인 target DNA를 반응시키면, 효율이 높아져 ds~DNA가 형성되며, background 전류를 저감할 수 있다. 본 논문에서는 이와 같은 방법으로 유전자검출의 고감도화를 도모하였다.

제안 방법

1) 포토리소그래픽 및 진공증착기술을 이용하여 복수의 미소전극을 병렬로 배치시킨 미소전극어레이형 DNA칩을 제작하였다.
1, 10, 100 nM 및 1 11M의 각 probe DNA (HIV SK38 probe) 용액을 각각 별개의 전극상에 스폿하여 고정화한 후, probe DNA의배열에 상호석인 배열을 갖는 target DNA (HIV SK38 target)를 37 C에서 1시간 hybridization시켰다. 그 후, 100 pM Hoechst 33258 수용액을 실온, 암실에서 10분간 방응시켜 세척하고, 전기화학측정 (LSV)을 하였다.
probe DNA (HIV SK38 probe)의 3' 말단을 FITC 수식한 probe DNA (HIV SK38 probe-FITC)를 이용하였다. 2, 4와 같은 방법으로 probe DNA를 전극상에 고정화하고 세척하였다.
1시간 hybridization시켰다. 그 후, 100 pM Hoechst 33258 수용액을 실온, 암실에서 10분간 방응시켜 세척하고, 전기화학측정 (LSV)을 하였다. 측정은 모두 0.
DNA 어레이어를 사용하여 probe DNA를 스폿할 경우, 통상은 스폿직경을 작게 하기 위하여 가는 슬릿가 든 프린팅칩 (type 1)을 사용한다. 그러나, 전극표면이 크므로 스폿직경도 크게 할 필요가 있으므로 슬릿이 두꺼운 프린팅칩 (type 2)을 사용하였고, 칩끝을 연마하여 스폿직경을 크게 (type 3) 하였다. 고정화 반웅후, 초순수로 전극을 세척하고, 비특이적으로 결합하여 있는 DNA롤 제거한 후, N₂로 건조시켰다.
금 전극 표면의 전처리로서 3N H₂SO₄ 용액을 전극상에 적하하여 30분 방치 하였다. 금 전극을 초순수로 세척한 후, 마이크로피펫 또는 DNA 어레이 어를 사용하여 티올기를 수식한 probe DNA 용액을 전극상에 스폿하고, 10℃에서 12시간 반응시켜 금 전극상에 probe DNA를 고정화하였다.
금 전극을 초순수로 세척한 후, 마이크로피펫 또는 DNA 어레이 어를 사용하여 티올기를 수식한 probe DNA 용액을 전극상에 스폿하고, 10℃에서 12시간 반응시켜 금 전극상에 probe DNA를 고정화하였다. DNA 어레이어를 사용하여 probe DNA를 스폿할 경우, 통상은 스폿직경을 작게 하기 위하여 가는 슬릿가 든 프린팅칩 (type 1)을 사용한다.
다시 비특이적으로 결합하여 있는 probe DNA를 충분히 제거하여 hybridization 의 효율을 향상시키기 위하여, 금 전극상에 1mM 6-mcrcaptohexanol (MCH) 용액을 적하하여 1시간 반응시켰다, 이 MCH 처리에 의하여 금 표면에는 황과의 화학적 친화력에 의하여 특이적으로 probe DNA 분자가 고정화되어 있으나, 통상은 비특이적 결합도 얼어난다. 따라서, 금 표면에서 자기조직화단분자막 (self-assembly monolayer : SAM)올 형성하는 MCH로 처리하면 비특이적 probe DNA 분자를 치환해서 제거한다.
세척 전후에서 형광현미경/냉각 CCD 카메라를 사용하여 전극상에서 발생하는 형광 신호를 관찰하였다. 또한, 얻어진 형광신호의 화상해석을 하여 세척 전후에 있어서 형광강도의 차이, 즉 probe DNA의 고정화량을 비교하였다.
2, 4와 같은 방법으로 probe DNA를 전극상에 고정화하고 세척하였다. 세척 전후에서 형광현미경/냉각 CCD 카메라를 사용하여 전극상에서 발생하는 형광 신호를 관찰하였다. 또한, 얻어진 형광신호의 화상해석을 하여 세척 전후에 있어서 형광강도의 차이, 즉 probe DNA의 고정화량을 비교하였다.
이 표식돤 유전자를 칩상에서 반응시키면 표적 유전자에 상호적인 배열을 갖는 probe DNA만이 결합 (hybridization)하고, 유전자 hybrid (ds DNA)를 형성한다. 이 유전자 hybrid가 형성된 장소만이 칩상에서 형광신호를 발현하므로, 이것을 공초점 레이저 현미경 등을 탑재한 해석장치로 측정한다. 형광 신호의 강도를 해석함으로써 질환의 원인이 되는 유전자를 신속히 알 수 있다.
또한, 그림 2는 HIV, HCV의 유전자 구성도에서 본 연구에서 사용한 올리고뉴클리오타이드의 위치를 나타내고 있다. 이들 올리고뉴클리오타이드를 TE 버퍼 (PH₈.0)를 적당량 가하여 희석하고, 각 농도의 probe DNA 용액을 조제하였다.
하였다. 이를 위하여 고집적형 바이오센서의 제작에 필요불가결한미세가공기술에 의하여 복수의 미소전극을 병열로 배치시킨 DMA칩을 제작하였다. 전극상에는 여러가지 유전자를 공유결합에 의하여 고정화하고, 복수의 유전자를 동시에 검출하였다.
이를 위하여 고집적형 바이오센서의 제작에 필요불가결한미세가공기술에 의하여 복수의 미소전극을 병열로 배치시킨 DMA칩을 제작하였다. 전극상에는 여러가지 유전자를 공유결합에 의하여 고정화하고, 복수의 유전자를 동시에 검출하였다. 그리고, 최종적으로 제작된 DNA칩을 이용하여, 신속 및 간편한 임상유천자검출에 웅용하는 것을 목적으로 하였다.
형광표식한 표적 유전자 (target DNA)를 칩상에서 반응시키면, 서로 상호적인 유전자만이 double strand (ds) DNA (ds-DNA)를형성하므로, 그 부분의 형광강도를 측정함으로써 유전자 기능의 해석이나 질환에 관여하는 유전자를 검출한다. [1-5].

대상 데이터

기판상에 금속박막을 증착하기 위하여 터버식 진공증착장치 (SANYU, SVC-700 TURBO-TM) 및 박막두께 측정장치 (일본천자, JTM200R)를 사용하였다. photofabricatione- 위한 장치로서 레지스트를 도포하기 위하여 스핀 코 터 (MIKAS'' :H-DX), 베이킹을 위하여 오븐 (YAMATO, DK300), 노광하기 위한 -얼라이너(Karl Suss, MUB3)를 사용하였다.
미소전극의 면적은 200x200#이며, 32개의 전극을 병렬시켰다. 본 논문에서는 복수의 유전자를 동시에 검출하기 위하여, 리드선을 각 커넥터에 납땜하여 접착하는 복잡한 공정을 생략하고, 간단히 전기 화학측정을 할 수 있는 카트리지형 DNA칩을 설계하였다.
본 논문에서 piobe DNA (HIV SK38: 5, -ATTTCTCCTACTgggATAggTggATTAT-3, t HIV SK39: 5'-gCATTCTggACATAAgACAAgg ACCAAA - 3') 및 target DNA (target DNA: 5'~C CCCCCCTCCCgggAgAgCCA TAgTTggT-3', 1 mismatched DNA: 5'-CCCCCCCTCCCgggAAAgCCATAgTTgg TT') 이다. 사용된 올리고뉴클리오타이드중에서 같은 종류의 probe DNA와 target DNA는 서로 상보적인 염기배열을 갖고 있으며, 배열이 다른 유전자를 control DNA (HIV SK39)로 하여 사용하였다.
본 논문에서 piobe DNA (HIV SK38: 5, -ATTTCTCCTACTgggATAggTggATTAT-3, t HIV SK39: 5'-gCATTCTggACATAAgACAAgg ACCAAA - 3') 및 target DNA (target DNA: 5'~C CCCCCCTCCCgggAgAgCCA TAgTTggT-3', 1 mismatched DNA: 5'-CCCCCCCTCCCgggAAAgCCATAgTTgg TT') 이다. 사용된 올리고뉴클리오타이드중에서 같은 종류의 probe DNA와 target DNA는 서로 상보적인 염기배열을 갖고 있으며, 배열이 다른 유전자를 control DNA (HIV SK39)로 하여 사용하였다. 여기서, -SH는 probe DNA 의 5' 말단이 티올기에 의하여 수식되어 있음을 의미한다.
보통은 기판으로서 베이크판과 같은 수지를 사용하지만, 실제 제작한 결과, 수지 표면이 약간의 요철이 있으므로, 리드선 부분에 단선이 많이 있었다. 슬라이드 유리를 기판으로 하여 사용한 경우는 거의 단선이 발생하지 않았으므로, 슬라이드 유리를 기판으로 사용하였다.
그 후, 100 pM Hoechst 33258 수용액을 실온, 암실에서 10분간 방응시켜 세척하고, 전기화학측정 (LSV)을 하였다. 측정은 모두 0.2 M 인산 버퍼중에서 하였으며, 소인속도 100 mV/s와 300'800 mV에서 소인하였다. 그림 3과 같이 1, 10, 100 nM 및 1 uM의 probe DNA를 전극상에 고정화한 경우는 농도가 증가함에 따라 Hoechst 33258 유래의 산화전류 피크도 상승하였으나, 1 pM의 probe DNA를 고정화하였을 때는 산화전류 피크가 100 nM일 때보다도 감소하였다.

이론/모형

전기화학적 DNA센서에 이용되는 intercalator로서 금속착체화합물을 이용한 연구로서, Wang [18, 9] 등은 카본 페이스트 전극상에 probe DNA를 흡착 고정하고, 검출 마커로서 Co(phen)33+를 이용하여 에이즈 바이러스 (human immunodeficiency virus : HIV) 유전자의 일부를 검출하였다. Co(phen)33i (phcn= phenanthroline 전기화학 측정법으로서 chrono- potentiometric stripping analysis (PSA)를 이용하였으며, L35ng/50#의 유전자를 검출하였으나, 감도적으로는 상당히 낮다. Thoip [10, 11] 등은 검 춤 마커로서 Ru(bpy)32+ (bpy=2, 2'-bipyridine) 와 Os(bpy);* 와 같은 inZercalator를 이용하여, 염기쌍의 조합을 인식할 수 있는 1엽기 mismatch 검출을 가능하게 하였다.

성능/효과

2) probe DNA의 고정화 농도에 대해서 검토하여 최적의 probe DNA의 농도는 100 nM이었다.
3) probe DNA (HIV SK38 probe)에 다른 염기배열을 갖는 target DNA (HIV SK38 target) 또는 콘트롤 DNA (HIV SK39 target)를 반응시켜, LSV를 측정한 결과, 양자의 산화 전류 값에 차이가 발생하여, target DNA를 전기화학적으로 검출할 수 있었다.
probe DNA를 수식하지 않은 전극에서는 형광이 관찰되지 않았으나, 수식한 전극은 반점상으로 Hoechst 33258 유래의 형광신호가 관찰되었으며, probe DNA가 고정화되어 있음이 확인되었다.

후속연구

이와 같은 결과에 기인한 원인으로서 과잉량의 probe DNA가 고정화되어 probe DNA층이 두껍게 되어 Hoechst 33258의 산화반응이 발생하기 어려운 상태가 되었다고생각된다. 이 결과로부터 probe DNA가 전극 표면에 고정화되어 있음을 확인할 수 있으므로 이후 동일 반응조건으로 전극상에 probe DNA의 고정화를 할 것이다.

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