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제안 방법
- Brassica juncea로부터 mRNA를 분리 하여 RT-PCR을 통해 y-glutamylcysteine synthetas(y-ECS)를 암호화 하는 cDNA를 증폭시켰다. RT-PCR에 사용된 primer는 forward 5'-CAC GGG ATC CAG GAA ACA CAC CAT GG-3', reverse 5*-TTT TTT TTT GAG CTC AAT GGG TAA-3* 이며, cloning을 위해 forward primer에서 4개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하고 reverse primerd에서 5개의 염기를 Sac I site에 맞게 치환하였다.
- 비교분석을 위해 Escherichia coli의 genomic DNA를 분리하여 PCR을 통해 Y-glutamylcysteine synthetas를 암호화 하는 유전자를 증폭시켰다. PCR에 사용되어진 primer는 forward 5*-GCT AAT GAA TTC GAT TTT GAC AGG-3', reverse 5'-CCT GAA TTC CTA GAA ATT TTG-31이며, forward primer에서 4개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하고 reverse primer에서 2개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하였다. 각각의 PCR product는 pGEM-T easy vector 에 cloning하여 E.
- cDNA를 증폭시켰다. RT-PCR에 사용된 primer는 forward 5'-CAC GGG ATC CAG GAA ACA CAC CAT GG-3', reverse 5*-TTT TTT TTT GAG CTC AAT GGG TAA-3* 이며, cloning을 위해 forward primer에서 4개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하고 reverse primerd에서 5개의 염기를 Sac I site에 맞게 치환하였다. 비교분석을 위해 Escherichia coli의 genomic DNA를 분리하여 PCR을 통해 Y-glutamylcysteine synthetas를 암호화 하는 유전자를 증폭시켰다.
- juncea의 y- ECS는 sequencing을 통하여 gene의 sequence를 확인하였다. Sequence가 확인된 B. juncea의 x-ECS는 protein 발현 vector인 pET 28a에 cloning 하여 Fig. 1의 (A)에서와 같이 gene construct를 구축하였고, E. coli (BL 21)에 transformation 하였다.
- PCR에 사용되어진 primer는 forward 5*-GCT AAT GAA TTC GAT TTT GAC AGG-3', reverse 5'-CCT GAA TTC CTA GAA ATT TTG-31이며, forward primer에서 4개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하고 reverse primer에서 2개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하였다. 각각의 PCR product는 pGEM-T easy vector 에 cloning하여 E. coli (JM109)에 trasformation 하였고, B. juncea의 y- ECS는 sequencing을 통하여 gene의 sequence를 확인하였다. Sequence가 확인된 B.
- 1의 (B)와 (C)의 recombinant construct를 구축할 예정이다. 또한 EcECS sense로형질 전환되어진 E. coli(BL 21)의 competent cell을 만들고 pET에 coloning 되어진 E. coli의 GS gene (EcGS) sense를 도입하여 EcECS sense와 EcGS sense를 가진 E. coli strain을 만들고, 같은 방법으로 EcECS antisens와 EcGS antisense를 가진 E. coli strain을 만들 것이다. 이 5개의 strain(BECS, EcECS sense, EcECS antisense, EcECS sense + EcGS sense, EcECS antisense + EcGS antisense)를 Northern bolt 분석을 통해 유전자의 overexpression을 확인하고, Westhern 비ot 분석을 통해 pfotein의 overeproduction을 확인할 것이다.
- RT-PCR에 사용된 primer는 forward 5'-CAC GGG ATC CAG GAA ACA CAC CAT GG-3', reverse 5*-TTT TTT TTT GAG CTC AAT GGG TAA-3* 이며, cloning을 위해 forward primer에서 4개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하고 reverse primerd에서 5개의 염기를 Sac I site에 맞게 치환하였다. 비교분석을 위해 Escherichia coli의 genomic DNA를 분리하여 PCR을 통해 Y-glutamylcysteine synthetas를 암호화 하는 유전자를 증폭시켰다. PCR에 사용되어진 primer는 forward 5*-GCT AAT GAA TTC GAT TTT GAC AGG-3', reverse 5'-CCT GAA TTC CTA GAA ATT TTG-31이며, forward primer에서 4개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하고 reverse primer에서 2개의 염기를 BamH I site에 맞게 치환하였다.
- coli strain을 만들 것이다. 이 5개의 strain(BECS, EcECS sense, EcECS antisense, EcECS sense + EcGS sense, EcECS antisense + EcGS antisense)를 Northern bolt 분석을 통해 유전자의 overexpression을 확인하고, Westhern 비ot 분석을 통해 pfotein의 overeproduction을 확인할 것이다. Overexpression 및 overeproduction이 확인된 E.
- 세포 내에서 Y- ECS gene의 overexpressione GSH의 생합성을 증진 시킬 수 있다. 이 연구에서 우리는 대장균 내에서배추 y-ECS gene을 도입하고, 비교 분석을 위해 E. coli로부터 분리한 y-ECS gene을 sense와 antisense 방향으로 도입하였다
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