[논문]자원식물로부터 미생물을 이용한 고부가가치 기능성 물질의 대량생산

양덕춘; 김세화; 민진우; 인준교; 이범수; 김종학

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한국자원식물학회 2008년도 추계학술발표회, 2008 Nov. 07, 2008년, pp.37 - 51

양덕춘 (경희대학교 한방재료가공학과 고려인삼명품화 사업단 및 인삼유전자원소재은행) , 김세화 (경희대학교 한방재료가공학과 고려인삼명품화 사업단 및 인삼유전자원소재은행) , 민진우 (경희대학교 한방재료가공학과 고려인삼명품화 사업단 및 인삼유전자원소재은행) , 인준교 ((주)바이오피아 생명공학연구소) , 이범수 ((주)바이오피아 생명공학연구소) , 김종학 ((주)바이오피아 생명공학연구소)

초록
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인삼은 재배적지에 대한 선택성이 매우 강한 식물이며, 기후 토양 등의 자연환경이 적당하지 않으면 인삼의 생육이 곤란하고, 생육이 가능하더라도 생산된 인삼의 형태, 품질 및 약효에서 현저한 차이를 나타내고 있다. 이러한 인삼의 식물학적 특성이 우리나라에서는 최적의 환경조건으로 인정되어 고려인삼은 세계적으로 최고의 품질로 높이 평가되는 이유이다. 하지만 실질적인 인삼의 생리활성물질에 대한 연구는 서구열강 및 일본에 의해 대다수 연구, 발표되었으며 또한 인삼의 우수성을 인정하여 넓은 영토와 수많은 과학적 지식으로 고려인삼의 우수한 품질을 앞서가려 하고 있는 것이 현실정이다. 특히 중국의 넓은 인삼재배면적에서 값싸게 생산된 인삼이 한국시장을 위협하고 있으며, 미국과 캐나다에서 수많은 연구비를 투자하여 자국삼인 화기삼의 홍보를 대대적으로 함으로서 전세계의 인삼시장의 변화를 유도하고 있고, 호주, 뉴질랜드에서도 청정인삼을 내세워 한국 및 전세계 인삼시장을 잠식해가고 있다. 이런 변화에 의하여 한때 인삼의 종주국으로 전세계의 인삼시장을 석권했던 한국의 고려인삼이 과거의 위상을 점차 잃어 가고 있는 실정이다. 따라서 인삼재배면적이 경쟁국과 비교해 상대적으로 열세인 한국의 고려인삼이 선택할수 있는 방법은 비록 생산은 적더라도 고부가가치인삼을 생산하여 명품화로 가야 할 것으로 생각된다. 명품화를 위해서는 우선 고려인삼의 효능을 밝혀 고기능성을 입증해야하고, 재배생산단계에서부터 농약, 중금속등에 노출되지 않고 병에 자유로운 청정재배를 통해 명품화를 이룩해야 하며, 특히 제품의 생산 및 유통단계에서 표준화를 통해서 전세계의 소비자가 믿고 사용할수 있도록 해야 할 것이다. 또한 인삼에만 함유된 인삼사포닌(ginsenoside)은 배당체로서 여러 미생물에 의하여 당사슬이 끊어짐으로서 새로운 사포닌이 등장하게 되는데 이러한 사포닌이 각종 함암, 면적, 치매, 관절등에 탁월한 효능을 보임으서 많은 연구들이 진행중에 있으며, 특히 인삼에만 함유된 것으로 알고 있었던 ginsenoside가 돌외(한약재명 칠엽담)에도 함유되어 있고 일부 성분은 미생물을 통해서 변환시킴으로 서 값비싼 인삼사포닌을 생장이 빠르면 비교적 값싼 돌외 사포닌으로부터 생산할수 있게 되었다. 본 세미나에서는 각종 미생물을 이용하여 인삼의 사포닌을 변환시키고 돌외 사포닌인 gypenoside를 ginsenoside로 변환시켜 대량생산할 수 있는 방법을 제시하고자 한다.

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문제 정의

GS514 균주는 인삼의 ginsenoside Rb1을 Rg3로 바꾸는 특어적인 활성을 가진 균주이다. 돌외의 사포닌은 인삼의 ginsenoside와 유사하기 때문에 GS514 균주자체의 활성이 gypenoside에도 영향이 있을 것이라고 추측되어 연구를 진행 하였다. 앞서 설명한 것과 같이 gypenoside V를 Rd로 분해하기 위해서는 α-L-Rhamnosidease이 필요하다.
따라서 본 연구에서는 β-glucosidase 생산 균주들을 이용하여 고분자 인삼사포닌인 finsenoside Rb1을 저분자 사포닌으로 전환시키고자 하였다.
본 발표에서는 이들 효소 중 β-glucosidase를 생산해 낼 수 있는 유산균을 김치 시료로부터 분리하고자 하였다.
하지만 돌외라는 식물에는 gypenoside라고 불리는 triterpenoid dammarane 계열의 사포닌이 존재하며 본 연구에서는 돌외에 함유되어진 protopanaxadiol계의 사포닌을 기질로 여러 미생물로부터 유래한 효소를 이용해 고부가가치의 인삼사포닌으로 변환을 하고자 하였다.

제안 방법

β-glucosidase 생산 균주들의 사포닌 전환 능력을 알아보기 위하여 유산균 배양액과 1 mM의 Rb1 수용액을 혼합하여 shaking incubator에서 48 시간 동안 현탁 배양하여 반응시킨 후 수포화 부탄올로 사포닌을 추출하였다.
Ginsenoside Rb1은 M. esteraromaticum GS514균주의 배양액과 2시간 간격으로 총 10시간 반응시켰다(FIg. 7).
Ginsenoside Rb1은 C. leidyia GP45균주의 배양액과 각각 12시간 간격으로 총 96시간 반응시켰다(Fig. 5).
2 μm filter로 멸균한 1 mM Rb1수용액을 같은 체적으로 혼합하여 30℃, 160 rpm으로 shaking incubator에서 반응시켰다. 반응 48 h 후 수포화부탄올을 첨가하여 반응을 중지시키고 부탄올 층은 TLC plate에 점적하여 Rb1의 전환여부를 확인하였다. Spotting한 TLC는 chloroform/methanol/ water(65:35:10 하층) 혼합용매로 5.
Ginsenoside Rb1의 전환 pathway Ginsenoside Rb1 전환균주를 LB broth에서 현탁 배양 후 30 ℃, 160 rpm shaking incubator에서 ginsenoside Rb1과 시간별로 반응시켰다. 반응물은 수포화부탄올로 추출한 후 농축하여 HPLC용 메탄올에 용해시켜 TLC 및 HPLC chromatography를 통하여 분석하였다. HPLC분석: HPLC분석 column은 C18(250 x 4.
본 연구는 인삼근권 토양과 각종 김치로부터 esculin 발색법을 이용하여 분리한 β-glucosidase활성균주를 이용하여 ginsenoside Rb1과 반응시켜 사포닌 전환여부를 확인하고 그 중 compound K와 ginsenoside Rg3 생산균주에 대하여 전환 pathway를 조사하였다.
본 연구에서는 강한 β-glucosidase활성을 가진 것으로 알려진 Aspergillus 속 미생물 효소를 이용하여 Gy XVII를 변환 시켰다.
본 연구에서는 인삼근권 토양과 각종 발효된 김치에서 esculin 발색법을 이요하여 β -glucosidase 활성 균주를 분리하고 ginsenoside Rb1과 반응시켜 사포닌 전환균주를 선발하였으며 TLC분석을 통하여 ginsenosidde Rb1을 각각 Rd, F2, Rg3, compound K 및 gypenoside XVII 등 사포닌으로의 전환능력을 확인하였다.
본 연구팀은 많은 균주의 screening을 통하여 ginsenoside Rg3 생산균주 M. esteraromaticum GS514를 분리하였고 ginsenoside Rb1에 대한 전환 pathway를 규명하였으며 NMR분석을 통하여 Rd3는 20(S)-Rg3(no data)임을 밝혔다.
이들 colony만을 선별하여 MRS agar plate 순수 배양될 때까지 계대하여 다시 한 번 esculin 배지에서 black complex 형성 여부를 확인한 후, 균주를 장기보관 하기 위해 glycerol stock solution을 만들어 deep freezer에 보관하였다.
이후 colony를 esculin이 들어있는 MRS agar plate에 옮겨 β-glucosidase활성을 확인하였다.
인삼근권 토양으로부터 esculin방법을 이용하여 β-glucosidase활성 균주를 분리하고 각각의 균주들을 nutrient broth에 현탁 배양하여 ginsenoside Rb1과 반응시켜 사포닌 전환균주를 선발하였다(Table 1).

대상 데이터

leidyia GP45균주와 Rg3생산균주 M. esteraromaticum GS514를 ginsenoside Rb1의 전환연구에 사용되었다.
실험에 사용한 ginsenoside Rb1은 Panax quinquefolium으로부터 분리하였고 standard Rb1, Rd, Rg3, compound K, Rh2는 경의대 인삼유전자원소재은행에서 분양받아 사용하였고 R2A, nutrient broth, LB broth (Luria-Bertani) 및 triptic soy broth배지는 Difco회사의 제품을 구입하여 사용하였다.
β-glucosidase활성균주는 주로 인삼근권 토양과 각종 김치로부터 선발하였다. 인삼근권 토양은 경기도 연천 인삼밭에서 취하여 polyethylene vinyl bag에 넣은 후 실험실로 운반하였다. 시료는 4℃에서 보존하면서 6시간 이내에 실험되었다.

성능/효과

104종의 김치로부터 MRS 배지에 의해 분리된 균주는 모두 127종이었으며, 이들 중 esculin agar plate에서 black complex를 형성한 균주, 즉 β-glucosidase 분비활성을 보인 유산균은 39 종으로 전체 균주의 약 31%로 나타났다.
TLC 분석 결과, 대부분의 균주들이 ginsenoside Rb1을 분해하지 못하거나 ginsenoside Rd로만 전환시키는 것을 볼 수 있었다.
하지만 돌외라는 식물에는 gypenoside라고 불리는 triterpenoid dammarane 계열의 사포닌이 존재하며 본 연구에서는 돌외에 함유되어진 protopanaxadiol계의 사포닌을 기질로 여러 미생물로부터 유래한 효소를 이용해 고부가가치의 인삼사포닌으로 변환을 하고자 하였다. TLC분석 결과를 통해 gypenoside V가 다양한 사포닌으로 변화 되는 것을 확인 할 수 있다. gypenoside V는 돌외사포닌의 대표적인 major사포닌으로 그 구조는 인삼의 ginsenoside Rb1과 매우 유사하다 Aspergillus속 미생물 효소를 통해 gypenoside V가 비록 미약하지만 Rd로 변화되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
TLC분석결과를 통하여 ginsenoside Rb1은 여러 가지 다양한 사포닌으로 변환되는 것을 관찰할 수 있으며 특히 Caulobacter leiyia GP45에 의하여 ginsenoside F2로, Sphingomonas echinoides GP50에 의하여 compound K로, Lactobacillus brevis KC-154균주에 의하여 ginsenoside Rd로, Microbacterium esteraromaticum GS514균주에 의하여 미약하지만 ginsenoside Rg3로 전환되는 것을 발견하였다(Fig. 5).
TLC분석을 통하여 ginsenoside Rb1은 주로 ginsenoside Rd, Rg3, F2 및 Rf값이 매우 큰 aglycone으로 추정되는 물질로 전환되는 것을 관찰할 수 있었으며 그중에서도 상당량의 Rg3를 생성하는 것을 관찰할 수 있었다.
TLC상에서 ginsenoside Rb1은 반응 36시간에 대부분 분해가 되었고 ginsenoside Rd와 R_f값이 standard Rd보다 약간 위의 NMR 스팩을 통하여 동정이 된 ginsenoside F2 (no data)는 그 함량이 점차적으로 많아졌다가 감소하였으며 compound K는 반응 48시간부터 지속적인 증가를 보여주었다. HPLC분석에서도 같은 결과를 나타냈다(Fig.
gypenoside V는 돌외사포닌의 대표적인 major사포닌으로 그 구조는 인삼의 ginsenoside Rb1과 매우 유사하다 Aspergillus속 미생물 효소를 통해 gypenoside V가 비록 미약하지만 Rd로 변화되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 9).
그중 인삼근권 토양에서 분리한 Caulobacter leidyia GP45 균주와 Microbacterium esteraromaticum GS514 균주는 ginsenoside Rb1을 compound K와 ginsenoside Rg3로 전환시켰으며 HPLC분석을 통하여 Rb1→Rd→F2→compound K 및 Rb1→Rd→Rg3의 순으로 분해되는 것을 확인하였다.
본 발표에서는 이들 효소 중 β-glucosidase를 생산해 낼 수 있는 유산균을 김치 시료로부터 분리하고자 하였다. 김치 시료를 serial dilution하여 MRS 배지에 배양해 본 결과, 유산균뿐만 아니라 여러 가지 효모들도 plate 상에 많이 나타나는 것을 볼 수 있었다. 그 중 유산균은 대부분 흰색의 cicular 형태의 colony로 나타났다.
앞서 설명한 것과 같이 gypenoside V를 Rd로 분해하기 위해서는 α-L-Rhamnosidease이 필요하다. 따라서 GS514 균주가 염에 특이적인 활성을 가지는 것이 보고되어 NaCl의 첨가를 통하여 효소활성을 증가시켜 반응을 시켜본 결과 GS514균주를 통해 최종적으로 ginsenoside Rg3가 생성되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 12). 이 결과는 인삼의 ginsenoside Rb1이 Rg3로 변환되는 것과 유사한 반응이라고 보여진다.
본 연구에서는 강한 β-glucosidase활성을 가진 것으로 알려진 Aspergillus 속 미생물 효소를 이용하여 Gy XVII를 변환 시켰다. 이를 TLC 및 HPLC로 확인한 결과 Gypenoside XVII 는 ginsenoside F2를 거쳐 인삼의 최종 대사산물 중 하나로 알려진 Conpound K로 변환되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 11).

후속연구

이 결과는 인삼의 ginsenoside Rb1이 Rg3로 변환되는 것과 유사한 반응이라고 보여진다. 더불어 GS514균주는 강한 glucosidase 및 rhamnosidase활성을 가지고 있고 인삼의 사포닌 분해 외에도 돌외의 사포닌을 인삼의 minor사포닌으로 분해 시키는 것으로 판단되어 향후 인삼사포닌을 생산하는데 유용할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	인삼에서 가장 중요한 성분으로 인정된 성분은 무엇인가?	인삼은 오가과(Araliaceae) 인삼속(Panax) 식물에 속하는 다년생 초본으로서 수 천년전부터 동아시아 국가에서 신비의 영약으로 사용되어 왔다. 인삼의 다양한 성분들 중 인삼사포닌 즉 ginsenoside가 가장 중요한 성분으로 인정되고 있으며 항암(Im et al., Li et al.
	인삼은 어떤 과, 속에 속하는가?	인삼은 오가과(Araliaceae) 인삼속(Panax) 식물에 속하는 다년생 초본으로서 수 천년전부터 동아시아 국가에서 신비의 영약으로 사용되어 왔다. 인삼의 다양한 성분들 중 인삼사포닌 즉 ginsenoside가 가장 중요한 성분으로 인정되고 있으며 항암(Im et al.
	실제 인삼을 추출하여 분석할 때 상당한 양이 검출되는 인삼 사포닌 6종은 무엇인가?	현재까지 40종 이상의 ginsenoside가 인삼으로부터 분리 보고되었다. 그러나 실제 인삼을 추출하여 분석할 때 상당한 양이 검출되는 인삼사포닌은 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1의 6종이며, 백삼이나 홍삼을 추출하여 분석하여 분석하는 경우 6종이며, 백삼이나 홍삼을 추출하여 분석하는 경우 이 6종이 전체 dammaranse 사포닌의 90% 이상을 차지하고 있으며 나머지 사포닌 성분들은 그 함량이 낮다. 이 중 6번 위치에 수소가 결합되어 있는 Rb1, Rb2, Rc, Rd등은 protopanaxadiol(PPD) 계열 사포닌이라 하고, 6번째 위치에 산소가 결합된 Re, Rg1등은 protopanaxatriol (PPT)계열 사포닌이라고 한다.

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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