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문제 정의
- 신경손상을 유발한 동물실험 모델에서 운동이 손상 후의 운동 및 감각기능 회복, 신경재생 등에 미치는 영향에 대해서 연구하여 여러 가지 근육 및 신경 기능 관련 변수들에 대한 결과가 보고되었으나 , 각 연구에서 이용된 운동의 종류, 운동 시작시기 , 강도 및 지속시간 등에 따라 다양하며, 때로는 상반되는 연구 결과들이 있었다. 이에 본 연구에서는 흰쥐 궁둥신경에 압궤손상을 준 후 트레드밀 운동을 통해 중간세사단백의 발현변화를 밝혀 뼈대근육의 재생을 증진시키는 효과를 갖는지 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 실험군 흰쥐들을 이중 트레드밀(Dual treadmill, model DJ2-2429, 대종기기, 한국)을 이용하여 미리 1주일 동안 하루에 30분씩 18m/분 속도로 적응 훈련을 시켰다. 각 실험군 별로 하루 60분 씩 주 5회 운동을 시켰으며, 트레드밀의 경사도는 10도, 속도는 20m/min(50%의 Vo2 max)이었다[29].
- 3% 과산화수소(H2O2)가 포함된 메틸알코올을 첨가시킨 용액에서 20분간 처리하고, PBS로 다시 세척한 다음 5%정상 말혈청(normal horse serum)에 30분간 유치하였다. 그 후 조직절편들을 세척하지 않고 가볍게 털어 낸 다음 일차항체인 mouse anti-rat desmin antibody(희석비율 1:200, Serotec, UK) 및 mouse anti-rat vimentin antibody(희석비율 1:200, Serotec, UK)를 각각 적용시켰다. 일차항체와 이차항체 (biotinylated horse anti-mouse IgG; Vector Lab, California, USA)를 실온에서 1시간 동안 적용시켰다.
- 효소조직화학적 염색을 하기 위하여 조직절편을 실온에서 20분 정도 말린 후 NADH-TR (Nicotina mide Adenine Dinucleotide-Tetrazolium Reductase)에 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 Acquimount(Polysciences, USA)로 봉입하였다. 근육조직의 검경은 광학현미경(Axiophot, Zeiss, Germany)으로 시행하였고, 사진은 디지털 카메라(Axicam, Zeiss, Germany)로 촬영하였다.
- 조직절편의 정색상태를 현미경하에서 확인한 후 세척한 후, 대조염색을 하고, 통상적인 과정으로 Permount (Polysciences, Warrington, PA, USA)로 봉입하였다. 비특이성 결합을 배제하기 위한 대조실험에서는 상기 면역염색과정 중 일차항체 적용과정을 생략하거나 ABC 용액 적용과정을 생략하였고, 이 과정을 거친 표본에서는 어떤 면역반응성도 나타나지 않아 면역염색의 특이성을 확인하였다.
- 7 kg/cm2)으로 30초간 연속적 적용하여 압궤손상을 주었다(De Koning 등 1986). 손상 후 12, 19, 26, 33, 61일째에 희생시켜 흰쥐의 오른쪽 장딴지근의 이는곳(origin)과 닿는곳(insertion)의 중간부위를 절취하여 약 10초간 동결 고정 후 동결절편기(cryocut, Reichert-Jung, Germany)를 사용하여 약 6㎛ 두께로 조직절편을 만들고 고정, 건조시켰다.
- 또한 압궤손상과 운동을 시키지 않은 흰쥐 2마리를 정상군으로 사용하였다. 실험군 흰쥐들을 이중 트레드밀(Dual treadmill, model DJ2-2429, 대종기기, 한국)을 이용하여 미리 1주일 동안 하루에 30분씩 18m/분 속도로 적응 훈련을 시켰다. 각 실험군 별로 하루 60분 씩 주 5회 운동을 시켰으며, 트레드밀의 경사도는 10도, 속도는 20m/min(50%의 Vo2 max)이었다[29].
- 실험동물은 성인 수컷 흰쥐(150-180g, SpragueDawley) 22마리를 실험군(10마리)과 대조군(10마리) 그리고 정상군(2마리)으로 사용하였다. 실험군은 궁둥신경 압궤손상 후 경과한 일수를 기준으로 12일군(5일간 운동군), 19일군(10일간 운동군), 26일군(15일간 운동군), 33일군(20일간 운동군) 및 61일군(40일간 운동군)으로 분류하였고, 각 실험군마다 2마리씩 운동시켰다. 각 실험군의 대조군으로 압궤손상을 준 후 운동을 시키지 않은 흰쥐 2마리씩을 사용하였다.
- 이어서 PBS로 세척한 조직절편을 0.05M Tris-HCl buffer에 0.05% DAB(3,3'-diaminobenzine tetra hydrochloride, Sigma Co, USA)와 0.01% 과산화수소가 혼합된 용액으로 처리하여 발색시켰다.
- 그 후 조직절편들을 세척하지 않고 가볍게 털어 낸 다음 일차항체인 mouse anti-rat desmin antibody(희석비율 1:200, Serotec, UK) 및 mouse anti-rat vimentin antibody(희석비율 1:200, Serotec, UK)를 각각 적용시켰다. 일차항체와 이차항체 (biotinylated horse anti-mouse IgG; Vector Lab, California, USA)를 실온에서 1시간 동안 적용시켰다. 그 후 조직절편들을 PBS로 수세한 다음 ABC(avidin-biotin horseradish peroxidase complex)용액(Vector Lab, California, USA)을 적용시켰다.
- 01% 과산화수소가 혼합된 용액으로 처리하여 발색시켰다. 조직절편의 정색상태를 현미경하에서 확인한 후 세척한 후, 대조염색을 하고, 통상적인 과정으로 Permount (Polysciences, Warrington, PA, USA)로 봉입하였다. 비특이성 결합을 배제하기 위한 대조실험에서는 상기 면역염색과정 중 일차항체 적용과정을 생략하거나 ABC 용액 적용과정을 생략하였고, 이 과정을 거친 표본에서는 어떤 면역반응성도 나타나지 않아 면역염색의 특이성을 확인하였다.
- 효소조직화학적 염색을 하기 위하여 조직절편을 실온에서 20분 정도 말린 후 NADH-TR (Nicotina mide Adenine Dinucleotide-Tetrazolium Reductase)에 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 Acquimount(Polysciences, USA)로 봉입하였다. 근육조직의 검경은 광학현미경(Axiophot, Zeiss, Germany)으로 시행하였고, 사진은 디지털 카메라(Axicam, Zeiss, Germany)로 촬영하였다.
대상 데이터
- 실험군은 궁둥신경 압궤손상 후 경과한 일수를 기준으로 12일군(5일간 운동군), 19일군(10일간 운동군), 26일군(15일간 운동군), 33일군(20일간 운동군) 및 61일군(40일간 운동군)으로 분류하였고, 각 실험군마다 2마리씩 운동시켰다. 각 실험군의 대조군으로 압궤손상을 준 후 운동을 시키지 않은 흰쥐 2마리씩을 사용하였다. 또한 압궤손상과 운동을 시키지 않은 흰쥐 2마리를 정상군으로 사용하였다.
- 각 실험군의 대조군으로 압궤손상을 준 후 운동을 시키지 않은 흰쥐 2마리씩을 사용하였다. 또한 압궤손상과 운동을 시키지 않은 흰쥐 2마리를 정상군으로 사용하였다. 실험군 흰쥐들을 이중 트레드밀(Dual treadmill, model DJ2-2429, 대종기기, 한국)을 이용하여 미리 1주일 동안 하루에 30분씩 18m/분 속도로 적응 훈련을 시켰다.
- 실험동물은 성인 수컷 흰쥐(150-180g, SpragueDawley) 22마리를 실험군(10마리)과 대조군(10마리) 그리고 정상군(2마리)으로 사용하였다. 실험군은 궁둥신경 압궤손상 후 경과한 일수를 기준으로 12일군(5일간 운동군), 19일군(10일간 운동군), 26일군(15일간 운동군), 33일군(20일간 운동군) 및 61일군(40일간 운동군)으로 분류하였고, 각 실험군마다 2마리씩 운동시켰다.
성능/효과
- 19일째의 일부 근육섬유에서 처음으로 관찰되었다(그림, 4F). Desmin에 양성 반응을 보이는 근육섬유들은 거의 관찰되지 않은 반면 vimentin 양성 반응을 보이고 있어서, desmin이 vimentin보다 일찍 사라지는 것을 알 수 있었다.
- 근육 손상 후 61일째에서는 대부분의 실험군 근육 섬유들이 정상 근육섬유로 회복되고 있었고, Desmin에 반응한 근육섬유는 거의 관찰되지 않았으며 근육섬유는 횡단면에서 각을 이루고 있어 정상 근육섬유임을 입증해 주고 있었다. 그러나 일부 대조군의 근육섬유들은 vimentin 양성 반응을 보이고 있었으며 이런 경우의 근육섬유는 회복 단계인 것을 시사해 주었다.
- Bornemann과 Schmalbruch[9]는 흰쥐의 궁둥신경을 절단 손상시킨 후 1주에서 52주까지 관찰한 결과 desmin이나 vimentin이 나타나지 않았다고 하였으나, Goebel[10]은 성인과 어린이의 탈신경의 NADH-TR반응에서 대조군에서는 diformazan 과립이 뭉쳐져 있음을 볼 수 있으나 실험군에서는 점점 diformazan 과립이 고르게 분포됨을 볼 수 있었다. 신경 손상 후 26일째 실험군에서 일부 근육섬유들은 둥근형태의 회복양상을 보였지만 대부분은 거의 정상으로 회복되어 있었다[그림, 4D, E).
- 재신경지배가 일어날 때 나타나는 표적근육섬유(target fiber)는 NADH-TR 반응에서 26일 실험군으로 위축된 근육섬유에서 desmin이 나타난다고 보고하였다. 이와 같이 탈신경된 근육섬유에서의 desmin의 출현여부는 의견이 분분하지만 본 연구에서는 desmin뿐만 아니라 vimentin도 발현됨이 확인되었다. 본 연구에서 신경손상 후 19일째 실험군에서는 근육섬유들은 크기가 작았고 여러개의 중심핵을 갖고 있었다.
후속연구
- 그러므로 신경손상 후 운동을 적용한 실험군과 운동을 적용하지 않은 대조군에서 desmin과 vimentin 중간세사단백 발현의 차이를 나타낸다는 본 연구의 결과는 재활의학이나 물리치료 분야의 신경 및 근육 계통의 질환에서 근육의 변성과 재생을 진단하는데 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
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