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제안 방법
- ) Merr. phytoplacenta callus를 50% EtOH로 추출한 시료에 daidzein이 함유되어 있음을 확인하기 위해 핵자기공명분광법 분석(Nuclear Magnetic Resonance analysis)을 실시하였다. 1H spectrum을 통해 수소의 종류와 수에 대한 정보 및 수소가 존재하는 주변정보를 탐색하고 13C spectrum을 통해 단일 peak로 나타나는 탄소의 수를 결정할 수 있는데, 여기서 50% 에탄올 추출물에 daidzein이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다[그림 4].
- 씨방에서 밑씨가 붙는 부위, 즉 phytoplacenta 조직에서 callus를 유도하여 배양하였고, 대두 태좌 유래 캘러스에서 생체 내에 조절자 역할을 하는 isoflavones인 daidzein이 함유됨을 발견하였다. 그리고 daidzein을 추출하는 보조용매의 조건을 찾았다.
- 기본배지는 Sigma사의 MS(Murashige and Skoog, 1962)배지를 사용하였고 30g/L sucrose, 2g/L gelrite , 0.5g/L MES Monohydrate (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid)및 Indole-3-acetic acid 2mg/L, Benzyladenine 2 mg/L를 첨가하고 pH를 5.8로 조절하였다. 2L 용기내에서 121℃ 15분이상 조건으로 고압 멸균한 뒤 무균대에서 직경 55mm 페트리 디쉬에 25ml씩 분주하여 고체배지로 응고시킨 후 사용하였다.
- isoflavones 분리를 위해 사용된 용매 기울기는 다음과 같다[표 1]. 준비된 5가지 샘플과 daidzein standard 시약을 HPLC로 분석한다.
- 표준물질을 액체크로마토그래피로 분석한 결과, daidzein(7,4'-Dihydroxyisoflavone) 표준물질은 22 min에 3.7AU(흡광도) 피크가 관찰되었으며 이와 동일한 시간대에 5가지 추출물의 피크를 분석하였다.
대상 데이터
- 5가지 샘플을 준비하여 이소플라본을 추출하였다. 4가지 샘플은 다음과 같이 준비한다; 증류수, 50% 에탄올, 50% 메탄올, 100% 메탄올을 각각 100ml씩 플라스크에 분주한 후 캘러스 10g(생중량)을 각각 넣는다.
- 0ml/min으로 설정한다. 그리고 용매는 두 가지를 사용하였다; Water (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유), Acetonitrile (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유). isoflavones 분리를 위해 사용된 용매 기울기는 다음과 같다[표 1].
- 일정시간 세포분열을 거듭하면 무정형의 세포괴가 형성되는데 이것이 callus이다[그림2]. 대두의 변연태좌를 모체로 발생한 세포 중 치밀하고 표면이 부드러운 것을 선별하여 3주간격으로 3개월간 배양하였다.
- 본 연구에서 사용된 재료는 Glycine max (L.)Merr.의 자방벽에 marginal placenta (변연태좌)조직을 절편체로 사용하여 유도한 callus 세포이다.
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