[논문]Saccharomyces Cervisiae의 분비성 단백질의 합성 효율에 관여하는 이황이성질화 효소의 활성 도메인

김성환; 김태윤; 강하라

Saccharomyces Cervisiae의 분비성 단백질의 합성 효율에 관여하는 이황이성질화 효소의 활성 도메인
The a Domain of Protein Disulfide Isomerase is critical for synthesis of secretory proteins in Saccharomyces Cervisiae 원문보기

김성환 (가톨릭대학교 의과학연구원) , 김태윤 (가톨릭대학교 의과학연구원) , 강하라 (인천대학교 생명과학부)

효모 (Saccharomyces Cervisiae)는 단일 세포의 형태로 존재하는 진핵 세포로써 동물세포와 유사한 기작으로 분비성 단백질을 생성한다. 따라서 박테리아와 달리 효모를 이용하면 당단백질이나 이황결합을 포함하는 분비성 단백질을 경제적으로 대량 합성할 수 있다. 효모의 필수 단백질 중 하나인 단백질 이황이성질화 효소는 소포체에 위치하며 분비성 단백질에 구조적으로 안정한 이황결합을 제공하는 효소이다. 본 연구는 단백질 이황이성질화 효소 (protein disulfide isomerase)가 지니고 있는 두 개의 활성도메인 중 분비성 단백질들의 합성 효율에 직접적으로 관여하는 부위를 찾는 연구이다. 효모 유전체로부터 단백질 이황이성질화 효소의 유전자 (PDI1)을 제거하고 효소의 변이 유전자를 주입한 후 효모의 성장 속도를 측정하였다. 또한 효모의 대표적 분비성 단백질을 각 변이 효소를 지니는 효모에 과발현시켜 합성 및 이황결합 형성 효율을 측정하였다. 단백질 이황이성질화 효소내 두 개의 활성 부위 중 아미노 말단쪽에 위치한 a 도메인에 있는 활성 부위가 분비성 단백질의 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 이황결합이나 당을 포함하는 외래 단백질의 고효율 합성을 위한 새로운 효모종 개발에 중요한 정보를 제공할 것으로 기대 된다.

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문제 정의

PDI의 각 활성 도메인 변이를 지니는 효모에서 발현되는 Bgl2의 이황결합과 세포내 발현정도를 확인해 보았다. 먼저 세포내에 있는 Bgl2의 이황결합의 유무는 non-reducing SDS-PAGE에서의 이동차이를 통해 확인 할 수 있었다 (그림 3).

제안 방법

PDI의 각 활성 도메인의 활성을 없앤 변이를 발현하는 효모를 액상 배지에 키워서 성장 곡선을 측정을 하였다. 그림 3-A에서 보는 것과 같이 정상적인 배양 조건에서는 wild type과 하나의 도메인의 활성을 없앤 CCSS와 SSCC는 성장에 큰 차이를 보이지 않았다.
Lane 1 – wild type PDI, Lane 2- SSCC, Lane 3- CCSS, Lane 4 – CSCS. non-reducing SDS-PAGE와 reducing SDS-PAGE에서 비교 되었다. non-reducing SDS_PAGE에서 위에 있는 band는 이황결합을 포함하지 않는 Bgl2를 나타내고, 아래에 있는 band는 이황결합을 포함하는 Bgl2를 나타낸다.
2의 OD600에서 배양을 시작하였다. 그리고 성장 곡선을 만들기 위해 매 90분 혹은 120분 마다 OD600을 측정하였다 (n=3). 분비성 단백질의 과발현을 위해서는 Galactose를 포함하는 SMM 배지에서 배양 되어 졌다.
분비성 단백질을 과발현 했을 때 이황결합 형성 효소인 PDI의 역할을 고찰 하였고, 그에 더해 PDI가 지니는 두 개의 활성 도메인중 분비성 단백질 발현 양에 더 큰 영향을 주는 도메인을 찾았다. 결과 아미노 말단에 위치한 a 도메인이 분비성 단백질인 Bgl2의 이황결합에 중요한 역할을 한다.
NEM은 환원형태의 cysteine 잔기에 결합하여 이후 여타 화학반응이 일어나지 않도록 하기 위해 첨가 되어 졌다. 추출된 단백질은 단백질 말단에 taq 으로 첨가된 flag이나 HA 에 대한 항체를 이용하여 western analysis를 통해 확인하였다. Bgl2의 경우 세포벽에 발현된 양을 확인하기 위해 immunostaining기법을 이용하였다.
[그림 4] Bgl2의 세포벽 발현. 현광현미경을 통해 Bgl2의 세포벽 발현을 확인하였다. DAPI는 핵을 Concanavalin A는 세포벽을 나타내 준다.

대상 데이터

a 와 a’ 도메인을 둘 다 없애면 효모는 죽는다. 따라서 두 도메인의 CxxC 모티브내의 두 번째 cysteine만 serine으로 바꾸어 CSCS를 최저의 활성을 지니는 변이체로 이용하였다 (그림 1).
실험에 사용된 발효 효모(Sacchromyces cervisiae) 는 Leucine이나 Uracil 이 배제된 SMM-Glucose 혹은 SMM-Galactose 배지를 이용하여 30도에서 배양되었다. 크로모좀에서 PDI1 유전자를 없앤 효모에 wild type PDI1이나 변이 유전자를 포함하는 플라스미드가 주입된 효모는 이전 연구를 통해 만들어 졌다(Vitu, Kim,.

이론/모형

추출된 단백질은 단백질 말단에 taq 으로 첨가된 flag이나 HA 에 대한 항체를 이용하여 western analysis를 통해 확인하였다. Bgl2의 경우 세포벽에 발현된 양을 확인하기 위해 immunostaining기법을 이용하였다.

성능/효과

PDI의 변이에 따른 Bgl2의 발현을 세포상에서 확인을 해보면 SSCC와 CSCS는 wild type과 CCSS에 비해 세포벽에 Bgl2의 발현이 적다는 것을 확인 할 수 있었다. (그림 4).
그림 3-A에서 보는 것과 같이 정상적인 배양 조건에서는 wild type과 하나의 도메인의 활성을 없앤 CCSS와 SSCC는 성장에 큰 차이를 보이지 않았다. 두 도메인의 활성을 모두 줄인 CSCS의 경우에만 성장이 급격이 둔화 되었다. 하지만, 이황결합을 포함하는 분비성 단백질인 Bgl2을 과발현 시켰을 때 wild type과 CCSS는 유사한 성장을 보이지만, SSCC의 경우 이들 보다 둔한 성장을 보였다.
하지만 두 활성 도메인 중 어떤 것이 실제로 기질의 폴딩과 이황결합에 중요하게 작용하는지는, 혹은 두 도메인이 어떤 협동적인 역할이 존재하는지에 대해서는 잘 알려져 있지 않는다. 이 연구에서는 두 활성 도메인 중 아미노말단 부위에 있는 도메인이 분 비성 단백질의 합성에 더 중요한 역할을 한다고 보여 준다. 하지만 두 도메인이 둘 다 지니고 있을때보다는 활성이 낮다.

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