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문제 정의
- 따라서 본 연구는 토끼 경골 선상골절 후 음극전극과 양극전극 모두를 표면전극을 이용하여 피부 표면에 부착시키는 비침습식 미세직류전류를 적용할 때 골절치유 과정에서 나타나는 골유합을 촉진시키는 화학적 매개체 가운데 BMP-4의 발현을 면역조직화학적으로 관찰하여 비침습식 미세직류전류 자극이 골유합에 미치는 영향을 알아보고자 한다.
제안 방법
- 05 ㎖ 씩 섞어 카테터를 이용해 혈관내 주사하여 마취시킨 다음 심장을 통해 4% paraformaldehyde-lysine-periodate(PLP)로 관류고정을 시행하였다. 골절 유발 후 각 해당 기간에 실험동물의 골절부위를 절제한 뒤 동일 고정액으로 후고정(4℃, overnight)을 시행하였다. 후고정 후 조직절편은 EDTA 용액에 침전시켜 탈회시켰다.
- 골절 후 골 유합에 대한 미세직류전류 자극의 효과를 관찰하기 위하여 본 연구에서는 체중 2.5∼3 ㎏내외의 6개월 령 뉴질랜드 웅성 토끼 24마리를 대상으로 전기 절단기를 이용하여 경골 골절 후 7-hole plate로 연결시킨 뒤 실험동물은 미세직류전류 자극을 적용한 실험 군과 비적용군인 대조군으로 나누었고, 시간경과에 따른 변화를 관찰하기 위하여 3일, 7일, 14일 및 28일군으로 나누어 BMP-4에 대한 면역조직화학적 염색을 실행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 실험 전 처치 후 실험군은 20∼25 ㎂ 범위의 지속적인 미세직류전류를 비침습식으로 24시간 적용한 뒤 미세전류 적용 기간별로 각각 3일군(3마리), 7일군(3마리), 14일군(3마리) 및 28일군(3마리) 등으로 분류하였다. 대조군은 미세전류를 적용하지 않고 각각 3일군(3마리), 7일군(3마리), 14일 군(3마리) 및 28일군(3마리) 등으로 무작위 배정하였다.
- 005%되게 첨가하여 갈색반응을 실시하였다. 면역조직 화학염색이 끝난 조직들은 통상적으로 탈수, 투명화과정을 거친 뒤 PMM(permanent mounting media)인 Clarion(Biomedia, U.S.A.)을 이용하여 cover glass로 봉입하였다.
- 미세전류 적용 후 적용 기간에 따른 실험군과 대조군과의 BMP-4발현위치 및 상대적 발현 정도를 비교하기 위해서 면역조직화학법을 적용한 후 광학현미경(Model BX50, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
- 음극전극은 골절 부위인 경골 전면에 근육이 없는 부위의 피부 표면에 부착하고, 양극전극은 골절 부위에서 약간 떨어진 경골 후면의 비복근 부위에 부착하였다. 미세전류 적용기간 동안 날마다 전극 부착 부위에 주사기를 이용하여 전도겔을 주입하여 피부저항을 최소화하였다. 자극 기간 동안 2∼3일 간격으로 전류의 강도를 확인하고 전극 부착 부위의 합병증 등의 변화를 확인하였다.
- 본 실험에서 전류의 강도는 선행 연구 결과들을 바탕으로 하였으나 표면전극을 이용한 비침습법임을 고려하여 20∼25㎂를 적용하였다.
- )을 사용하였다. 수술 후 마취에서 깨어난 직 후부터 실험기간 동안 하루 24 시간 동안 지속적으로 미세직류전류를 비침습적으로 적용하였다. 음극전극은 골절 부위인 경골 전면에 근육이 없는 부위의 피부 표면에 부착하고, 양극전극은 골절 부위에서 약간 떨어진 경골 후면의 비복근 부위에 부착하였다.
- 실험동물을 케타민을 이용하여 마취시킨 후 우측 뒷다리 내측의 피부를 절개하고 경골에 붙어 있는 근막을 분리시킨 후 골절을 유발시킬 부위의 골막을 일정부분 제거한 뒤 경골 밑으로 핀셋을 집어넣어 골절시킬 부위를 결정하고 가는 전기절단기를 경골의 횡으로 관통시켜 완전골절을 유발시켰다. 수술찌꺼기를 제거하고 소동물용 7-hole plate을 골절된 경골 위에 부착시켜 경골의 굴곡 정도와 맞춘 다음 토끼의 경골 표본과 비교 하여 정상 위치로 각도를 설정한 뒤 스크루(screw)를 박고 C-arm을 이용해 골절접합의 이상유무를 관찰한 뒤 근막과 피부를 봉합하였다. 완전 골절을 유발시킨 실험군은 전단력에 의한 과도한 가관절증 (pseudoarthrosis)을 방지하기 위해 미세전류를 적용하지 않는 안쪽에 브래이스(brace)를 대어 고정시켰다.
- 시간경과에 따른 BMP-4의 발현 정도를 비교하기 위해 BMP-4에 대한 일차항체인 mouse anti-BPM IgG(Vector Lab. Inc., U.S.A.)를 이용하여 면역조직화 학염색을 시행하였다. 조직절편 위에 일차항체를 침적시켜 실온에서 12시간 내지 24시간 동안 반응시켰는데 일차 항체의 희석은 1:500의 농도로 .
- 실험 전 처치 후 실험군은 20∼25 ㎂ 범위의 지속적인 미세직류전류를 비침습식으로 24시간 적용한 뒤 미세전류 적용 기간별로 각각 3일군(3마리), 7일군(3마리), 14일군(3마리) 및 28일군(3마리) 등으로 분류하였다.
- 실험동물들은 각 해당시간에 ketamine hydrochloride와 xylazine hydrochloride를 체중 100 g 당 .15 ㎖ 및 .05 ㎖ 씩 섞어 카테터를 이용해 혈관내 주사하여 마취시킨 다음 심장을 통해 4% paraformaldehyde-lysine-periodate(PLP)로 관류고정을 시행하였다. 골절 유발 후 각 해당 기간에 실험동물의 골절부위를 절제한 뒤 동일 고정액으로 후고정(4℃, overnight)을 시행하였다.
- 실험동물을 케타민을 이용하여 마취시킨 후 우측 뒷다리 내측의 피부를 절개하고 경골에 붙어 있는 근막을 분리시킨 후 골절을 유발시킬 부위의 골막을 일정부분 제거한 뒤 경골 밑으로 핀셋을 집어넣어 골절시킬 부위를 결정하고 가는 전기절단기를 경골의 횡으로 관통시켜 완전골절을 유발시켰다. 수술찌꺼기를 제거하고 소동물용 7-hole plate을 골절된 경골 위에 부착시켜 경골의 굴곡 정도와 맞춘 다음 토끼의 경골 표본과 비교 하여 정상 위치로 각도를 설정한 뒤 스크루(screw)를 박고 C-arm을 이용해 골절접합의 이상유무를 관찰한 뒤 근막과 피부를 봉합하였다.
- 수술찌꺼기를 제거하고 소동물용 7-hole plate을 골절된 경골 위에 부착시켜 경골의 굴곡 정도와 맞춘 다음 토끼의 경골 표본과 비교 하여 정상 위치로 각도를 설정한 뒤 스크루(screw)를 박고 C-arm을 이용해 골절접합의 이상유무를 관찰한 뒤 근막과 피부를 봉합하였다. 완전 골절을 유발시킨 실험군은 전단력에 의한 과도한 가관절증 (pseudoarthrosis)을 방지하기 위해 미세전류를 적용하지 않는 안쪽에 브래이스(brace)를 대어 고정시켰다.
- 후고정 후 조직절편은 EDTA 용액에 침전시켜 탈회시켰다. 완전 탈회가 이루어진 것을 육안으로 확인한 후 동결보호(Cryoprotection, 20% sucrose, 4℃, overnight)를 거친 다음 통상적 방법으로 탈수 및 투명화 과정을 거쳐 파라핀 포매한 뒤 미세 절단기(Model Bright5040, Bright, U.S.A.)를 사용하여 10 ㎛ 두께의 조직절편을 제작하였다.
- 자극 기간 동안 2∼3일 간격으로 전류의 강도를 확인하고 전극 부착 부위의 합병증 등의 변화를 확인하였다.
- 전원은 9V의 어댑터를 사용하였고 저항기를 달아 저항의 변화에 영향을 받지 않고 지속적으로 20∼25 ㎂ 범위의 일정한 출력강도를 갖는 미세전류기를 실험실에서 자체 제작하였다.
- 토끼의 경골 골절 후 미세직류전류자극에 의한 경골내 BMP-4의 발현 변화를 면역조직화학적 방법을 이용해 비교 관찰하였다. 경골 골절 3일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응 (+)을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응 (++)을 보였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 체중 2.5∼3 ㎏ 내외의 6개월령 뉴질랜드 웅성 토끼 24마리를 사용하였다.
- 전원은 9V의 어댑터를 사용하였고 저항기를 달아 저항의 변화에 영향을 받지 않고 지속적으로 20∼25 ㎂ 범위의 일정한 출력강도를 갖는 미세전류기를 실험실에서 자체 제작하였다. 전극은 직경 1 ㎝의 Ag-AgCl 전극(Biopack, U.S.A.)을 사용하였다. 수술 후 마취에서 깨어난 직 후부터 실험기간 동안 하루 24 시간 동안 지속적으로 미세직류전류를 비침습적으로 적용하였다.
성능/효과
- BMP-4의 발현은 비침습식 미세전류를 적용한 실험 군과 자연치유군인 대조군 모두 시간이 경과함에 따라 통계학적으로 유의하게 증가하다가 감소되었다. 그러나 실험군에서 초경골 골절 3일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응(+) 을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응(++)을 보였다.
- 경골 골절 7일 후 대조군은 하버씨계의 동심원과 간질층판을 중심으로 중등도의 갈색의 면역양성반응(++)을 보였으나 실험군의 경우 바깥층판을 포함하여 매우 강한 갈색의 면역양성반응(++++)을 보였다. 경골 골절 14일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판과 동심원을 중심으로 강한 갈색의 면역양성반응(+++)을 보였으며 실험군 또한 강한 면역양성반응(+++)을 보였다. 그 후 점차 감소하여 경골 골절 28일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응 (+)을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응 (++)을 보였다(그림 1, 표 1).
- 토끼의 경골 골절 후 미세직류전류자극에 의한 경골내 BMP-4의 발현 변화를 면역조직화학적 방법을 이용해 비교 관찰하였다. 경골 골절 3일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응 (+)을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응 (++)을 보였다. 경골 골절 7일 후 대조군은 하버씨계의 동심원과 간질층판을 중심으로 중등도의 갈색의 면역양성반응(++)을 보였으나 실험군의 경우 바깥층판을 포함하여 매우 강한 갈색의 면역양성반응(++++)을 보였다.
- 경골 골절 3일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응 (+)을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응 (++)을 보였다. 경골 골절 7일 후 대조군은 하버씨계의 동심원과 간질층판을 중심으로 중등도의 갈색의 면역양성반응(++)을 보였으나 실험군의 경우 바깥층판을 포함하여 매우 강한 갈색의 면역양성반응(++++)을 보였다. 경골 골절 14일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판과 동심원을 중심으로 강한 갈색의 면역양성반응(+++)을 보였으며 실험군 또한 강한 면역양성반응(+++)을 보였다.
- 경골 골절 3일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응 (+)을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응 (++)을 보였다. 경골 골절 7일 후 대조군은 하버씨계의 동심원과 간질층판을 중심으로 중등도의 갈색의 면역양성반응(++)을 보였으나 실험군의 경우 바깥층판을 포함하여 매우 강한 갈색의 면역양성반응(++++)을 보였다. 경골 골절 14일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판과 동심원을 중심으로 강한 갈색의 면역양성반응(+++)을 보였으며 실험군 또한 강한 면역양성반응(+++)을 보였다.
- 경골 골절 14일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판과 동심원을 중심으로 강한 갈색의 면역양성반응(+++)을 보였으며 실험군 또한 강한 면역양성반응(+++)을 보였다. 그 후 점차 감소하여 경골 골절 28일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응 (+)을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응 (++)을 보였다(그림 1, 표 1).
- 경골 골절 14일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판과 동심원을 중심으로 강한 갈색의 면역양성반응(+++)을 보였으며 실험군 또한 강한 면역양성반응(+++)을 보였다. 그 후 점차 감소하여 경골 골절 28일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응 (+)을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응 (++)을 보였다.
- BMP-4의 발현은 비침습식 미세전류를 적용한 실험 군과 자연치유군인 대조군 모두 시간이 경과함에 따라 통계학적으로 유의하게 증가하다가 감소되었다. 그러나 실험군에서 초경골 골절 3일 후 대조군은 하버씨계의 간질층판을 중심으로 약한 갈색의 면역양성반응(+) 을 보였으나 실험군의 경우 중등도의 면역양성반응(++)을 보였다. 경골 골절 7일 후 대조군은 하버씨계의 동심원과 간질층판을 중심으로 중등도의 갈색의 면역양성 반응(++)을 보였으나 실험군의 경우 바깥층판을 포함하여 매우 강한 갈색의 면역양성반응(++++)을 보였다.
- 본 실험에서는 골형성 단백질인 BMP-4의 반응에 대한 결과 분석에서 실험군은 골절 7일 후 까지 대조군에 비해 강한 면역양성반응을 보였다. 특히 경골 골절 7일후 실험군은 매우 강한 갈색의 면역영성반응(++++)을 보여, 중등도의 면역양성반응(++)을 보인 대조군에 비해 확연한 BMP-4의 발현을 나타내었다.
- 위의 결과로 보면 골절 후 미세전류를 비침습적으로 적용할 때 치유과정 초기에 골형성단백질인 BMP-4의 발현을 증가시켜 골절 치유를 촉진시킴을 알 수 있다.
- 본 실험에서는 골형성 단백질인 BMP-4의 반응에 대한 결과 분석에서 실험군은 골절 7일 후 까지 대조군에 비해 강한 면역양성반응을 보였다. 특히 경골 골절 7일후 실험군은 매우 강한 갈색의 면역영성반응(++++)을 보여, 중등도의 면역양성반응(++)을 보인 대조군에 비해 확연한 BMP-4의 발현을 나타내었다. 이는 골절 시 미세직류전류 자극의 적용은 골형성 단백질 중 골절부위의 가골 형성 및 회복에 강한 역할을 하는 BMP-4의 발현을 활성화 시켜 골절 초기의 회복에 효과적임을 보여주고 있다.
후속연구
- 그러나 BMP가 골절 후 3일 후에 발현되기 시작하여 2주안에 거의 감소된다는 선행의 연구들과 본 실험의 결과인 미세직류전류자극이 토끼 경골의 골절치유에서 BMP가 4주까지 지속적으로 발현되는 것이 다소 상이점을 나타냈다[13][14][15][16]. 이는 지속적인 전류 강도의 차이로 인식되고 있지만 이에 대한 후속 연구가 필요하다고 본다.
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