초록 ▼

본 발명은 단백질의 발현분비를 위한 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더 펩티드 서열(Y), 효소적 또는 화학적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X1), 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결된 하기식 I의 융합단백질을 암호화하는 DNA 및 전기 DNA를 포함하는 발현계를 사용하여 인슐린을 제조하는 방법

본 발명은 단백질의 발현분비를 위한 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더 펩티드 서열(Y), 효소적 또는 화학적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X1), 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결된 하기식 I의 융합단백질을 암호화하는 DNA 및 전기 DNA를 포함하는 발현계를 사용하여 인슐린을 제조하는 방법에 관한 것이다.[Y]-[X1]-[B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-chain] (식 I)본 발명에 의하면, 효율적이며 고생산성의 유전자 재조합 인슐린의 생산방법이 제공된다.

대표청구항 ▼

단백질의 발현분비를 위한 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더 펩티드 서열(Y), 효소적 또는 화학적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X1), 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결된 하기식 I의 융합단백질을 암호화하는 DNA:[Y]-[X1]-[B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-c

단백질의 발현분비를 위한 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 리더 펩티드 서열(Y), 효소적 또는 화학적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X1), 인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 연결된 하기식 I의 융합단백질을 암호화하는 DNA:[Y]-[X1]-[B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-chain] (식 I)인슐린의 B쇄의 아미노산 서열(B-chain), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X2), 1개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 링커 서열(linker), 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열(X3), 인슐린의 A쇄의 아미노산 서열(A-chain)이 순서대로 결합된 하기식 II의 융합단백질을 암호화하는 DNA:[B-chain]-[X2]-[linker]-[X3]-[A-chain] (식 II)제 1항 또는 2항에 있어서, 융합단백질의 효소적 절단에 사용되는 아미노산 서열 X1, X2 또는 X3 는 트롬빈에 의해 절단가능한 아미노산 서열인 것을 특징으로하는 DNA.제 1항 또는 2항에 있어서, 융합단백질의 효소적 절단에 사용가능한 아미노산 서열 X1, X2, 또는 X3는 X1 = GlySerLeuGlnProArg(서열번호 1) X2 = ArgGlyHisArgPro(서열번호 2), 또는 X3 = ProArg 인 것을 특징으로 하는 DNA.제 1항 또는 2항에 있어서, 링커의 아미노산 서열은 GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeu GlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln(서열번호 3) 인 것을 특징으로 하는 DNA.제 1항에 있어서, 리더 펩티드 서열은, 바실러스 속 세균의 세포융합단백질(CWP, cell wall protein)의 하나인 MWP(middle wall protein) 단백질의 N말단으 로부터 9개의 아미노산 잔기로 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA.제 1항에 있어서, DNA의 5'말단에 CWP의 시그널펩티드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA. 서열표의 서열번호 21에 표시된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA.제 8항에 있어서, 서열표의 서열번호 20에 표시된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하 는 DNA.제 1, 2항 및 8항의 어느 한 항에 기재된 DNA의 5' 말단에 원핵생물 또는 진핵생물에의 유전자 재조합 융합단백질 발현에 필요한 프로모터 영역을 함유하는 DNA 서열이 연결되어 있는 DNA. 제 10항에 있어서, 프로모터 영역을 함유하는 DNA 서열은 바실러스속 세균유래인 것을 특 징으로 하는 DNA.제 11항에 있어서, 프로모터 영역을 함유하는 DNA 서열은 바실러스속 세균의 CWP유래인 것을 특징으로 하는 DNA.제 10항에 기재된 DNA를 포함하는 벡터.제 13항에 기재된 벡터로 형질전환된 숙주세포.제 13항에 기재된 벡터로 형질전환된 바실러스속 세균.제 15항에 있어서, 바실러스속 세균은 바실러스 브레비스(Bacillus brevis)인 것을 특징 으로 하는 세균.제 14항 또는 15항에 기재된 숙주세포 또는 세균을 배지 중에서 배양하고, 목적 DNA를 발현시켜 전기 DNA에 의해 암호화되는 융합단백질을 회수한 다음, 전기 융합단백질을 효소적 절단 처리하여 인슐린을 분리하는 단계를 포함하는 인슐린의 제조방법.제 17항에 있어서, 융합단백질은 서열표의 서열번호 21로 표시된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.제 17항에 있어서, 발현된 융합단백질을 숙주세포 또는 세균에서, 또는 배양하여 수득된 배지에서 분리정제하는 것을 특징으로 하는 방법.제 17항에 있어서, 효소적 절단 처리는 트롬빈과 카르복시펩티다제 B로 행하는 것을 특징 으로 하는 방법.서열표의 서열번호 21에 표시된 아미노산 서열을 가지는 융합단백질.<