초록 ▼

본 발명은 단백질의 방향적 진화(directed evolution)를 위한 무작위 코돈 돌연변이 방법(random codon-based mutagenesis)에 관한 것으로, 구체적으로 트랜스포존(transposone)을 이용하여 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 무작위 위치의 연속한 염기서열을 특정 혹은 무작위 코돈으로 치환시키거나, 특정 혹은 무작위 코돈을 목적 DNA의 무작위 위치에 삽입시키거나, 또는 목적 DNA 상에서 무작위 위치의 연속한 염기서열을 삭제시켜 DNA 상에 돌연변이를 유발시키고 이들이 발현하는 단백질

본 발명은 단백질의 방향적 진화(directed evolution)를 위한 무작위 코돈 돌연변이 방법(random codon-based mutagenesis)에 관한 것으로, 구체적으로 트랜스포존(transposone)을 이용하여 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 무작위 위치의 연속한 염기서열을 특정 혹은 무작위 코돈으로 치환시키거나, 특정 혹은 무작위 코돈을 목적 DNA의 무작위 위치에 삽입시키거나, 또는 목적 DNA 상에서 무작위 위치의 연속한 염기서열을 삭제시켜 DNA 상에 돌연변이를 유발시키고 이들이 발현하는 단백질의 스크리닝을 통해 원하는 방향으로 성질이 개선된 유용 돌연변이 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 얻는 방법에 관한 것이다.

대표청구항 ▼

다음과 같은 단계를 포함하는, 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법:1) 목적 DNA의 무작위 위치에 Tn4430, Tn7, mini-Mu 및 이들에서 유도된 트랜스포존으로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스포존(transposon)을 삽입시킨 후, 트랜스포존의 양쪽 말단부위에 있는 제한효소부위를 절단하여 트랜스포존을 제거함으로써 무작위 위치에서 한번 절단된 구조의 목적 이중가닥 DNA들을 얻는 단계,2) 목적 DNA의 절단된 양쪽 말단 중 한쪽 말단 부위에 존재하는 트랜스포존 유래의 뉴클레오티드 서열과

다음과 같은 단계를 포함하는, 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법:1) 목적 DNA의 무작위 위치에 Tn4430, Tn7, mini-Mu 및 이들에서 유도된 트랜스포존으로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스포존(transposon)을 삽입시킨 후, 트랜스포존의 양쪽 말단부위에 있는 제한효소부위를 절단하여 트랜스포존을 제거함으로써 무작위 위치에서 한번 절단된 구조의 목적 이중가닥 DNA들을 얻는 단계,2) 목적 DNA의 절단된 양쪽 말단 중 한쪽 말단 부위에 존재하는 트랜스포존 유래의 뉴클레오티드 서열과 트랜스포존 삽입 과정 중 중복 복제된(duplicated) 목적 DNA 뉴클레오티드 서열을 제거하는 단계,3) 2) 단계에서 뉴클레오티드 서열이 제거된 부위에 치환시키고자하는 코돈 뉴클레오티드를 삽입하고, 목적 DNA의 다른 쪽 말단에 트랜스포존 유래의 뉴클레오티드 서열과 목적 DNA의 연속한 3 bp의 뉴클레오티드 서열을 제거하는 단계,4) 3) 단계에서 제조된 목적 DNA의 두 말단을 자가연결(self-ligation)시켜 무작위 위치에서 돌연변이된 라이브러리를 제조하는 단계, 및5) 4) 단계에서 제조된 라이브러리를 적당한 숙주세포에서 발현시킨 후 목적 단백질을 선발하거나 스크리닝하여 원하는 특성을 가진 변이 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 변이 폴리뉴클레오티드를 얻는 단계.