초록

본 발명은 단백질의 요구되는 입체구조의 수득률을 증가시키는 방법을 제공한다. 특히 실시형태에서, 본 발명은 요구되는 배위이성질체의 상대적 비율을 증가시키기에 충분한 시간 동안 재조합 단백질의 제제와 환원/산화 결합 시약을 접촉시키는 것을 포함한다.

대표청구항 ▼

포유동물 세포에 의해 생산된 재조합 단백질의 제제를 환원/산화 결합 시약과 pH 약 7 내지 약 11 에서 접촉시키는 단계 및 요구되는 입체구조를 갖는 재조합 단백질의 제제의 분획을 분리시키는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 수득률을 증가시키는 방법.제 1 항에 있어서, 재조합 단백질은 두 개 또는 그 이상의 도메인을 함유함을 특징으로 하는 방법.제 2 항에 있어서, 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인은 안정한 입체구조를 가지며,

포유동물 세포에 의해 생산된 재조합 단백질의 제제를 환원/산화 결합 시약과 pH 약 7 내지 약 11 에서 접촉시키는 단계 및 요구되는 입체구조를 갖는 재조합 단백질의 제제의 분획을 분리시키는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 수득률을 증가시키는 방법.제 1 항에 있어서, 재조합 단백질은 두 개 또는 그 이상의 도메인을 함유함을 특징으로 하는 방법.제 2 항에 있어서, 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인은 안정한 입체구조를 가지며, 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인은 불안정한 입체구조를 가짐을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 재조합 단백질은 수용체의 세포외 도메인을 포함함을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 재조합 단백질은 가용성 형태의 TNF - 수용체임을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 재조합 단백질은 Fc 융합 단백질임을 특징으로 하는 방법.제 6 항에 있어서, 재조합 단백질의 제제는 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼으로부터 정제됨을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 재조합 단백질은 다음 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법 : 가용성 IL - 4 수용체, 가용성 IL - 1 Ⅱ 형 수용체, 가용성 Flt3 리간드, 가용성 CD40 리간드, CD39, CD30, CD27, TEK/Ork, IL - 15, 가용성 IL - 15 수용체, Ox40, GM - CSF, RANKL, RANK, TRAIL, 가용성 TRAIL 수용체, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, Ⅷ 인자, Ⅸ 인자, 아포리포 단백질 E, 아포리포 단백질 A - I, IL - 2 수용체, IL - 2 길항물질, α - 1 항트립신, 칼시토닌, 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀(insulinotropin), 인슐린 - 유사 성장 인자, 부갑상선 호르몬, 인터페론, 슈퍼옥시드 디스뮤타아제, 글루카곤, 에리트로포이에틴, 항체, 글루코세레브로시다아제, Fc - 융합 단백질, 글로빈, 신경 성장 인자, 인터루킨 및 군체 자극 인자.제 1 항에 있어서, pH 는 약 7 내지 약 10 임을 특징으로 하는 방법.제 9 항에 있어서, pH 는 약 7.6 내지 약 9.6 임을 특징으로 하는 방법.제 10 항에 있어서, pH 는 약 8.6 임을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 환원/산화 결합 시약은 글루타티온을 포함함을 특징으로 하는 방법.제 12 항에 있어서, 환원된 글루타티온 대 산환된 글루타티온의 비율은 약 1 : 1 내지 약 100 : 1 임을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 환원/산화 결합 시약은 시스테인을 포함함을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 접촉시키는 단계를 약 4 내지 약 16 시간 동안 수행함을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 접촉시키는 단계를 약 25 ℃ 에서 수행함을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 접촉시키는 단계를 약 4 ℃ 에서 수행함을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 접촉시키는 단계를 산성화에 의해 중단시킴을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 분리시키는 단계는 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 단백질 농도가 약 0.5 내지 약 10 ㎎/㎖ 임을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 환원/산화 결합 시약에서 환원시킨 티올 대 단백질에서 이황화물 결합의 비율은 약 320 : 1 내지 약 64,000 : 1(환원시킨 티올 : 이황화물 결합)임을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 요구되는 입체구조를 갖는 재조합 단백질의 제제의 분획을 멸균의 벌크(bulk) 형태로 제형화시킴을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.제 1 항에 있어서, 요구되는 입체구조를 갖는 재조합 단백질의 제제의 분획을 멸균의 단위 투여형태로 제형화시킴을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.제 4 항에 있어서, 요구되는 입체구조는 수용체의 동족 리간드에 대한 높은 결합 친화력을 가짐을 특징으로 하는 방법.제 5 항에 있어서, 요구되는 입체구조는 TNF 에 대한 높은 결합 친화력을 가짐을 특징으로 하는 방법.제 25 항에 있어서, TNF 는 TNF - α 임을 특징으로 하는 방법.요구되는 배위이성질체의 상대적 비율을 증가시키기에 충분한 시간 동안 글리코실화 재조합 단백질의 둘 또는 그 이상의 배위이성질체의 혼합물을 함유하는 글리코실화 재조합 단백질의 제제와 환원/산화 결합 시약을 접촉시키는 단계 및 혼합물에서 요구되는 배위이성질체의 상대적 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 글리코실화 재조합 단백질의 요구되는 입체구조를 증진시키는 방법.제 27 항에 있어서, 글리코실화 재조합 단백질은 둘 또는 그 이상의 도메인을 함유함을 특징으로 하는 방법.제 28 항에 있어서, 글리코실화 재조합 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인은 안정한 입체구조를 가지며, 글리코실화 재조합 단백질의 하나 또는 그 이상의 도메인은 불안정한 입체구조를 가짐을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 글리코실화 재조합 단백질은 수용체의 세포외 도메인을 포함함을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 글리코실화 재조합 단백질은 가용성 형태의 TNF - 수용체임을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 글리코실화 재조합 단백질은 Fc 융합 단백질임을 특징으로 하는 방법.제 32 항에 있어서, 글리코실화 재조합 단백질의 제제는 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼으로부터 정제됨을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 글리코실화 재조합 단백질은 다음 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법 : 가용성 IL - 4 수용체, 가용성 IL - 1 Ⅱ 형 수용체, 가용성 Flt3 리간드, 가용성 CD40 리간드, CD39, CD30, CD27, TEK/Ork, IL - 15, 가용성 IL - 15 수용체, Ox40, GM - CSF, RANKL, RANK, TRAIL, 가용성 TRAIL 수용체, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, Ⅷ 인자, Ⅸ 인자, 아포리포 단백질 E, 아포리포 단백질 A - I, IL - 2 수용체, IL - 2 길항물질, α - 1 항트립신, 칼시토닌, 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀(insulinotropin), 인슐린 - 유사 성장 인자, 부갑상선 호르몬, 인터페론, 슈퍼옥시드 디스뮤타아제, 글루카곤, 에리트로포이에틴, 항체, 글루코세레브로시다아제, Fc - 융합 단백질, 글로빈, 신경 성장 인자, 인터루킨 및 군체 자극 인자.제 27 항에 있어서, pH 는 약 7 내지 약 10 임을 특징으로 하는 방법.제 35 항에 있어서, pH 는 약 8.6 임을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 환원/산화 결합 시약은 글루타티온, 시스테인, DTT(디티오트레이톨), 2 - 머캅토에탄올 및 디티오니트로벤조에이트 중에서 선택함을 특징으로 하는 방법.제 37 항에 있어서, 환원/산화 결합 시약은 환원된 글루타티온을 포함함을 특징으로 하는 방법.제 38 항에 있어서, 환원된 글루타티온의 농도는 약 1 mM 내지 약 10 mM 임을 특징으로 하는 방법.제 37 항에 있어서, 환원/산화 결합 시약은 환원된 시스테인을 포함함을 특징으로 하는 방법.제 37 항에 있어서, 환원/산화 결합 시약에서 환원시킨 티올 대 단백질에서 이황화물 결합의 비율은 약 320 : 1 내지 약 64,000 : 1(환원시킨 티올 : 이황화물 결합)임을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 단백질 농도가 약 0.5 내지 약 10 ㎎/㎖ 임을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 접촉시키는 단계를 약 4 내지 약 16 시간 동안 수행함을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 약 25 ℃ 에서 수행함을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 약 4 ℃ 에서 수행함을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 접촉시키는 단계는 산성화에 의해 중단됨을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 측정하는 단계는 하나 또는 그 이상의 크로마토그래피 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 측정하는 단계는 결합 반응을 포함함을 특징으로 하는 방법.제 27 항에 있어서, 요구되는 배위이성질체를 갖는 글리코실화 재조합 단백질의 제제의 분획을 분리시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.제 49 항에 있어서, 요구되는 배위이성질체를 멸균의 단위 투여형태로 제형화시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.제 30 항에 있어서, 요구되는 배위이성질체는 수용체의 동족 리간드에 대한 보다 높은 결합 친화력을 가짐을 특징으로 하는 방법.제 31 항에 있어서, 요구되는 배위이성질체는 TNF 에 대한 보다 높은 결합 친화력을 가짐을 특징으로 하는 방법.제 52 항에 있어서, TNF 는 TNF - α 임을 특징으로 하는 방법.포유동물 세포에 의해 생산되고 환원/산화 결합 시약과 접촉시키며 요구되지 않는 입체구조를 갖는 단백질의 분획으로부터 분리시킨 재조합 단백질을 멸균의 단위 투여 형태로 제형화시키는 방법.제 54 항의 방법에 의해 생산된 TNFR : Fc 의 약학적 조성물.<