초록 ▼

본 발명은 종에 노출되는 경우 모(母)비개질 분자에 비해 감소된 면역원성을 갖는, 인공 개질 단백질, 바람직하게는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은, 무엇보다도, 그의 C-말단에서 생물학적으로 활성인 비면역원성 분자, 바람직하게는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편의 N-말단으로 공유결합적으로 융합된 면역글로불린 분자 또는 그의 단편으로 본질적으로 구성된 신규한 면역글로불린 융합 단백질에 관한 것이다. 특별한 구현예에서, 본 발명은, 상기 언급된 바와 같이 생물학적 또는 약학적 효능을 나타

본 발명은 종에 노출되는 경우 모(母)비개질 분자에 비해 감소된 면역원성을 갖는, 인공 개질 단백질, 바람직하게는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은, 무엇보다도, 그의 C-말단에서 생물학적으로 활성인 비면역원성 분자, 바람직하게는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 단편의 N-말단으로 공유결합적으로 융합된 면역글로불린 분자 또는 그의 단편으로 본질적으로 구성된 신규한 면역글로불린 융합 단백질에 관한 것이다. 특별한 구현예에서, 본 발명은, 상기 언급된 바와 같이 생물학적 또는 약학적 효능을 나타내는 비면역학적 표적 분자에 융합된 항체의 FC 부분으로 구성된 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 분자는 하나 이상의 아미노산 잔기 위치에서 변경되지만, 원칙적으로 비변경 분자와 비교해 동일한 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 변화는 T 세포 에피토프와 같이 동정된 분자의 구역 내에 만들어지며, 이는 생 숙주에 면역 반응을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 컴퓨터 보조 방법에 의한, MHC 클래스 II 분자 결합 부위에 대한 T 세포 에피토프 값의 계산을 포함하는 상기 에피토프의 동정에 의해 상기 융합 단백질의 신규한 제조 방법에 관한 것이다.

대표청구항 ▼

제 1 단백질이 면역글로불린 분자 또는 그의 단편이며, 제 2 단백질/폴리펩티드가 각각 서로에게 직접 또는 링커 분자에 의해 연결된 비면역글로불린 표적 폴리펩티드(X) 인 제 1 단백질/폴리펩티드 및 제 2 단백질/폴리펩티드로 본질적으로 구성되는, 모(母) 융합 단백질로부터 유도된 면역원성 개질 융합 단백질로서; 상기 개질 융합 단백질이 상기 모 융합 단백질과 상이한 아미노산 서열을 가지며, 소정의 종의 면역계에 노출되는 경우, 모 융합 단백질에 비해 그의 아미노산 서열 내 T 세포 에피토프 수의 감소에 의해 감소된 면역원성을 나타

제 1 단백질이 면역글로불린 분자 또는 그의 단편이며, 제 2 단백질/폴리펩티드가 각각 서로에게 직접 또는 링커 분자에 의해 연결된 비면역글로불린 표적 폴리펩티드(X) 인 제 1 단백질/폴리펩티드 및 제 2 단백질/폴리펩티드로 본질적으로 구성되는, 모(母) 융합 단백질로부터 유도된 면역원성 개질 융합 단백질로서; 상기 개질 융합 단백질이 상기 모 융합 단백질과 상이한 아미노산 서열을 가지며, 소정의 종의 면역계에 노출되는 경우, 모 융합 단백질에 비해 그의 아미노산 서열 내 T 세포 에피토프 수의 감소에 의해 감소된 면역원성을 나타내는 개질 융합 단백질. 제 1 항에 있어서, 상기 T 세포 에피토프가 MCH 클래스 II 분자 결합기에 결합할 수 있는 펩티드 서열인 개질 융합 단백질. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 표적 폴리펩티드 (X) 가 그의 N-말단에 의해 면역글로불린 부분의 C-말단에 연결되는 개질 융합 단백질. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 소정의 종이 인간인 개질 융합 단백질.제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 구성원이 링커 분자 L 을 통해 융합되는 개질 융합 단백질.제 4 항에 있어서, 상기 링커 분자 L 의 면역원성이 없거나 또는 감소한 개질 융합 단백질. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 부분의 C-말단 구역 및 비면역글로불린 표적 폴리펩티드 (X) 의 N-말단 구역으로 나타내는 접합 영역 (junction region) 이 감소된 수의 T 세포 에피토프를 갖거나 또는 갖지 않는 개질 융합 단백질.제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 부분 또는 그의 단편의 면역원성이 덜한 개질 융합 단백질.제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리펩티드 (X) 부분의 면역원성이 덜한 개질 융합 단백질. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자 또는 그의 단편이 IgG1 또는 IgG2 인 개질 융합 단백질. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 단편이 Fc 부분인 개질 융합 단백질. 제 11 항에 있어서, 상기 Fc 부분이 Fc 수용체에 대한 감소된 친화성을 갖는 개질 융합 단백질. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 하기 식을 갖는 개질 융합 단백질:Fc - Ln - X (식 중, Fc 는 면역글로불린 분자 (항체) 의 Fc 부분이며, X 는 비면역글로불린 표적 폴리펩티드이며, L 는 링커 펩티드이며, n = 0 또는 1 이며, 여기서 X 및/또는 L 에는 모 분자에 비해 감소된 면역원성을 나타내는 아미노산 잔기 변형이 포함된다). 제 13 항에 있어서, 적어도 X 의 면역원성이 감소되거나 또는 없는 개질 융합 단백질.제 14 항에 있어서, 추가적으로 Fc 및 X 및 임의로는 Fc 및 L 및/또는 L 및 X 사이의 융합 구역의 T 세포 에피토프의 수가 감소되거나 또는 없는 개질 융합 단백질. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 식을 갖는 개질 융합 단백질: A - Ln - X (식 중, A 는 전체 항체 또는 그의 sFv, Fab, Fab', F(ab')2 단편이며, X 는 비면역글로불린 표적 폴리펩티드이며, L 는 링커 펩티드이며, n = 0 또는 1 이며,여기서, A 및/또는 X 및/또는 L 에는 모 분자에 비해 감소된 면역원성을 나타내는 아미노산 잔기 변형이 포함된다). 제 16 항에 있어서, 적어도 A 또는 X 의 T 세포 에피토프의 수가 감소되거나 또는 없는 개질 융합 단백질. 제 17 항에 있어서, 추가적으로 A 및 X 및 임의로는 A 및 L 및/또는 L 및 X 사이의 융합 구역의 면역원성이 감소되거나 또는 없는 개질 분자. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, A 가 하기 군으로부터 선택되는 개질 분자: 항 EGF 수용체 (HER1) 항체, 항 HER2 항체,항 CDx 항체, 항 싸이토카인 수용체 항체, 항 17-1A 항체, 항 KSA 항체, 항 GP IIb/IIIa 항체, 항 인테그린 수용체 항체, 항 VEGF 수용체 항체. 제 19 항에 있어서, 항체가 하기 군으로부터 선택되는 개질 융합 단백질:모노클로날 항체 225 및 유도체, 모노클로날 항체 425 및 유도체, 모노클로날 항체 KS 1/4 및 유도체, 모노클로날 항체 14.18 및 유도체, 모노클로날 항체 4D5/HER2 (Herceptin) 및 유도체, 모노클로날 항체 17-1A 및 유도체, 모노클로날 항체 7E3 및 유도체, 모노클로날 항체 LM609, P1F6 및 14D9.F8 및 유도체, 모노클로날 항체 DC-101 및 유도체, 모노클로날 항 I1-2R 항체 (Zenapax) 및 유도체.제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 폴리펩티드 X 가 하기 군으로부터 선택되는 개질 융합 단백질:싸이토카인, 인테그린 저해제, 가용성 싸이토카인 수용체, 당단백질, 호르몬, 당단백질 호르몬, 렙틴, 성장 호르몬, 성장 인자, 항 혈우병 인자, 항원, 싸이토카인 수용체 길항 물질. 제 21 항에 있어서, 표적 폴리펩티드 X 가 하기 군으로부터 선택되는 개질 융합 단백질:IL-2, G-CSF, GM-CSF, EPO, TPO, TNFα, 가용성 TNF 수용체, IL-12, IL-8, FGF, TGF, EGF, VEGF, PMSA, IGF, 인슐린, hGH, RGD-펩티드, 엔도스타틴, 안지오스타틴, BDNF, CNTF, 단백질 c, 인자 IX, 및 생물학적으로 활성인 이들의 단편.제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 군으로부터 선택되는 개질 융합 단백질: MAb KS 1/4 - IL2, MAb 14.18 - IL2 MAb 425 - IL2, MAb c425 - IL2, MAb h425 - IL2, MAb 425 TNFα,MAb 225 - IL2, MAb c225 - IL2 MAb 4D5 - IL2, MAb DC1O1 - Il2, MAb LM609 - IL2, Fc - IL2, Fc - TNFa, Fc - G-CSF, Fc - EPO, Fc - 렙틴, Fc - KGF, Fc - BDNF, Fc-CNTF, FC-β-세레브로시다아제, Fc - TPO, Fc - GM-CSF. 제 1 항 내지 제 23 항 및 제 36 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열. 제 24 항에 있어서, 하기를 포함하는 DNA 서열:(i) 시그날 서열, (ii) IgG1, IgG2 또는 IgG3 항체의 모든 도메인 또는 Fc, sFV, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 도메인을 코딩하는 DNA 서열, 및 (iii) 폴리펩티드 (X) 를 코딩하는 DNA 서열, 및 임의로는(iii) 링커 분자를 코딩하는 DNA 서열. 제 24 항 또는 제 25 항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터. 제 1 항 내지 제 23 항 및 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을, 임의로는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 함유하는 약제학적 조성물.하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 개질 융합 단백질의 제조 방법: (i) 모 융합 단백질 또는 그의 일부의 아미노산 서열의 결정 단계; (ii) 시험관내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 검정을 사용하여 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합의 결정을 포함하는 임의의 방법으로 융합 단백질의 아미노산 서열 내에서 하나 이상의 잠재적인 T 세포 에피토프를 동정하는 단계, (iii) 원래 동정된 T 세포 에피토프 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변경에 의한 신규한 서열 변이체의 고안 단계로서, 상기 변이체가 시험관내 또는 컴퓨터 이용 (in silico) 기술 또는 생물학적 검정을 사용하는 MHC 분자에 대한 펩티드의 결합으로 또는 T 세포에 대한 펩티드-MHC 복합체의 결합으로 결정된 바와 같은, T 세포 에피토프 서열의 활성 또는 갯수 및/또는 상기 생물학적 분자로부터 유도된 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 동종이형의 갯수를 본질적으로 감소시키거나 또는 제거하는 방법으로 개질되도록 하는 고안 단계;(iv) 상기 서열 변이체를 제조합 DNA 기술로 구축하고, 요망되는 특성을 가진 하나 이상의 변이체를 동정하기 위해 상기 변이체를 시험하는 단계; 및 (v) 단계 (ii) - (iv) 를 임의로 반복하는 단계로서, 단계 (ii) 에 따른 T 세포 에피토프 서열의 동정이 하기 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 단계:(a) 공지된 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 구역의 선택 단계; (b) 예정된 단일 크기를 가지며, 선택된 구역으로부터 3 개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 중복 아미노산 잔기 절편의 연속 샘플링 단계; (c) 상기 샘플링된 아미노산 잔기 절편에 존재하는 각각의 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 대해 정해진 값을 더하여 각각의 상기 샘플링된 절편에 대한 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 계산하는 단계; 및 (d) 상기 절편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 스코어를 기준으로, 펩티드의 치료 유용성을 본질적으로 감소시키지 않으면서, 펩티드에 대한 전체 MHC 클래스 II 결합 스코어를 변화시키기 위한, 개질에 적합한 하나 이상의 상기 절편의 동정 단계.제 28 항에 있어서, 단계 (c) 가 하기 단계에 의해 12-6 반데르 발스 (van der Waal's) 리간드-단백질 에너지 반발 항 및 리간드 배치 에너지 항을 포함하도록 변형된 봄 스코어링 함수 (Boehm scoring function) 를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법: (1) MHC 클래스 II 분자 모델의 첫번째 데이타 베이스를 제공하는 단계; (2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델에 대해 허용된 펩티드 골격의 두번째 데이타 베이스를 제공하는 단계; (3) 상기 첫번째 데이타 베이스로부터 모델을 선택하는 단계; (4) 상기 두번째 데이타 베이스로부터 허용된 펩티드 골격을 선택하는 단계; (5) 각각의 샘플링된 절편에 존재하는 아미노산 잔기 측쇄의 동정 단계; (6) 각각 샘플링된 절편에 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화성 값을 결정하는 단계; 및 임의로는 (7) 각각의 상기 모델 및 각각의 상기 골격에 대해 (1) 내지 (5) 의 단계를 반복하는 단계. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 샘플링된 아미노산 잔기 절편이 13 개의 아미노산 잔기로 구성된 방법. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 연속적인 샘플링된 아미노산 잔기 절편이 1 내지 5 개의 아미노산 잔기로 중복되는 방법. 제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 원래 존재하는 T 세포 에피토프 서열 중 1 - 9 개의 아미노산 잔기가 변경되는 방법. 제 32 항에 있어서, 임의의 원래 존재하는 T 세포 에피토프 서열 중 한 아미노산 잔기가 변경되는 방법. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변경이 원래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들) 의 특이적인 위치(들)에서의 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 치환, 결실 또는 부가인 방법. 제 34 항에 있어서, 치환, 결실 또는 부가에 의한 부가적인 추가적 변경이, 상기 생물학적 분자의 생물학적 활성을 복원하도록 수행되는 방법. 하기 군으로부터 선택되는 면역원 개질 인공 단백질로서: (i) Y - (L) - X (식 중, Y 는 싸이토카인이며, X, (L) 은 상기 정의된 바와 같은 분자이다), (ii) P - (L) - X (식 중, P 는 비통상적 당화 부분을 갖는 단백질이며, X, (L) 은 상기 정의된 바와 같은 분자이다), (iii) A - (L) - X (식 중, A 는 면역글로불린 또는 그의 단편이며, X (L) 은 상기 정의된 바와 같은 분자이다), 상기 모 인공 단백질의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖는 모 인공 단백질로부터 유도되며, 소정의 종의 면역계에 노출되는 경우 모 융합 단백질에 비해 T 세포 에피토프의 감소된 갯수에 의한 감소된 면역원성을 나타내며, 여기서, 상기 T 세포 에피토프는 제 28 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득될 수 있는 MCH 클래스 II 분자 결합기에 결합할 수 있는 펩티드 서열인 면역원성 개질 인공 단백질.제 36 항에 있어서, 적어도 A 또는 X 또는 Y 또는 P 의 면역원성이 개질된 인공 단백질.<