초록 ▼

질병 인자 및 이차 질병 인자의 진단 또는 감별 진단을 위한 새로운 방법이 개시된다. 개시된 방법은 TEMPCR이라 칭하여지는 새로운 증폭 전략을 사용하여 핵산 서열이 알려져 있는 어느 질병 인자 및/또는 이차 질병 인자로부터 표적 서열의 민감하고 특이적인 증폭을 가능케 한다. 상기 TEMPCR 방법은 (저농도로 존재하는) 검출되어지는 질병 인자 또는 이차 질병 인자에 특이적인 적어도 한 세트의 표적 엔리치먼트 프라이머 및 (고농도로 존재하는) 적어도 한 쌍의 공유 표적 증폭 프라이머를 사용한다. 적어도 한 쌍의 상기 표적 엔리치먼

질병 인자 및 이차 질병 인자의 진단 또는 감별 진단을 위한 새로운 방법이 개시된다. 개시된 방법은 TEMPCR이라 칭하여지는 새로운 증폭 전략을 사용하여 핵산 서열이 알려져 있는 어느 질병 인자 및/또는 이차 질병 인자로부터 표적 서열의 민감하고 특이적인 증폭을 가능케 한다. 상기 TEMPCR 방법은 (저농도로 존재하는) 검출되어지는 질병 인자 또는 이차 질병 인자에 특이적인 적어도 한 세트의 표적 엔리치먼트 프라이머 및 (고농도로 존재하는) 적어도 한 쌍의 공유 표적 증폭 프라이머를 사용한다. 적어도 한 쌍의 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 상기 표적 증폭 프라이머에 대한 바인딩 서열을 포함한다. 따라서, 상기 TEMPCR 방법의 사용은 멀티플렉스 증폭 반응이 멀티플렉스 증폭 파라미터의 실험적인 최적화가 필요없이 수행되도록 한다. 상기 TEMPCR 방법과 함께 사용되는 핵산 분리 및 표적 서열의 검출 방법이 또한 개시된다.

대표청구항 ▼

적어도 하나의 제1 및 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍 및 적어도 하나의 제1 표적 증폭 프라이머쌍을 포함하는 반응 혼합물에서 증폭을 수행하는 것을 포함하며, 상기 표적 증폭 프라이머는 FSP 및 RSP를 포함하며, 상기 방법은a. i) 주형으로서, 적어도 하나의 인자(agent)로부터 얻어지며 상기 인자의 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 핵산|ii) 상기 핵산에 하이브리드되고 상기 적어도 하나의 표적 서열을 브라켓팅(bracketing)하는 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍|iii) 상기 핵산에 하이브리드되고 상기 적어도 하나의

적어도 하나의 제1 및 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍 및 적어도 하나의 제1 표적 증폭 프라이머쌍을 포함하는 반응 혼합물에서 증폭을 수행하는 것을 포함하며, 상기 표적 증폭 프라이머는 FSP 및 RSP를 포함하며, 상기 방법은a. i) 주형으로서, 적어도 하나의 인자(agent)로부터 얻어지며 상기 인자의 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 핵산|ii) 상기 핵산에 하이브리드되고 상기 적어도 하나의 표적 서열을 브라켓팅(bracketing)하는 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍|iii) 상기 핵산에 하이브리드되고 상기 적어도 하나의 표적 서열을 브라켓팅하며, 적어도 하나의 표적 서열에 근접 위치되며, 그리고 각각은 5``말단에 표적 증폭 프라이머중 하나의 서열에 상응하는 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 포함하는 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍| 및iv) 제1 증폭 반응이 다수의 제1 증폭 산물을 생성하도록 하며, 여기서 상기 제1 증폭 산물의 적어도 일부가 상기 수퍼 프라이머 바인딩 태그의 적어도 하나의 컴플리먼트를 함유하여 이에 따라 적어도 하나의 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 형성하는 제1 증폭 반응을 위한 증폭 시약 및 조건| 을 이용하는 제1 증폭 반응| 및b. i) 주형으로서, 상기 적어도 하나의 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 함유하는 제1 증폭 산물의 일부|ii) 상기 제1 증폭 산물의 일부상의 상기 수퍼 프라이머 바인딩 사이트에 바인딩하는 제1 표적 증폭 프라이머쌍| 및iii) 제2 증폭 반응이 상기 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 다수의 제2 증폭 산물을 생성하도록 하는 제2 증폭 반응을 위한 증폭 시약 및 조건|을 이용하는 제2 증폭 반응을 포함하는 멀티플렉스 프라이머-기초 증폭 방법.제 1항에 있어서, 상기 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍은 Ro 및 Fo 프라이머를 포함하며, 상기 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍은 Fi 및 Ri 프라이머를 포함하며 그리고 상기 제1 표적 증폭 프라이머는 FSP 및 RSP를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 2항에 있어서, 상기 Fi상의 수퍼 프라이머 바인딩 태그는 FSP가 상기 Fi 프라이머상의 수퍼 프라이머 바인딩 태그의 컴플리먼트에 바인딩하도록 FSP의 서열과 일치하며 그리고 상기 Ri상의 수퍼 프라이머 바인딩 태그는 RSP가 상기 Ri 프라이머상의 수퍼 프라이머 바인딩 태그의 컴플리먼트에 바인딩하도록 RSP의 서열과 일치하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 각 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-40뉴클레오타이드, 10-30뉴클레오타이드 및 10-20뉴클레오타이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-40뉴클레오타이드, 10-30뉴클레오타이드 및 10-20뉴클레오타이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 각 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-20뉴클레오타이드이며 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 30-40뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 각 제1 표적 증폭 프라이머쌍의 길이는 10-20뉴클레오타이드이며 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 30-40뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 저농도로 존재하며 상기 표적 증폭 프라이머는 고농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.제 8항에 있어서, 상기 저농도는 0.002-0.2μM의 농도이며 상기 고농도는 0.2-1.0μM의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 표적 서열의 지수적 증폭에 충분하지 않은 농도로 존재하며 상기 표적 증폭 프라이머는 표적 서열의 지수적 증폭에 충분한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 각 표적 엔리치먼트 프라이머는 동일한 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 적어도 하나의 표적 엔리치먼트 프라이머는 다른 표적 엔리치먼트 프라이머보다 높은 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 각 표적 증폭 프라이머는 동일한 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 적어도 하나의 표적 증폭 프라이머는 다른 표적 증폭 프라이머보다 높은 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 14항에 있어서, 상기 보다 높은 농도의 표적 증폭 프라이머는 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 제1 증폭 반응 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하며 제2 증폭 반응 공정 조건은 표적 증폭 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 16항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 공정은 증폭 조건, 92-94℃에서 0.5-1분, 50-55℃에서 1-2.5분 및 70-72℃에서 0.5-1분을 포함하며 그리고 상기 표적 증폭 공정은 증폭 조건, 94℃에서 15-30초, 50-55℃에서 15-30초 및 72℃에서 15-30초를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 제1 증폭 반응 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두 개의 완전 사이클 및 선택적인 증폭 공정의 적어도 두 개의 완전 사이클을 포함하며 그리고 제2 증폭 반응 공정 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 18항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 공정은 증폭 조건, 92-94℃에서 0.5-1분, 50-55℃에서 1-2.5분 및 70-72℃에서 0.5-1분을 포함하며, 선택적 증폭 공정은 증폭 조건, 92-94℃에서 15-30초, 70-72℃에서 1-2분을 포함하며 그리고 상기 표적 증폭 공정은 증폭 조건, 94℃에서 15-30초, 50-55℃에서 15-30초 및 72℃에서 15-30초를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 19항에 있어서, 선택적인 증폭은 상기 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 함유하는 제1 증폭 산물을 생성하는 방향으로 편향된 것을 특징으로 하는 방법.제 19항에 있어서, 각 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-20뉴클레오타이드이며 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 30-40뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 3이상의 표적 증가 프라이머쌍을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 2이상의 표적 증폭 프라이머를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 24항에 있어서, 상기 인자는 바이러스 및 박테리아로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 24항에 있어서, 상기 인자는 아데노바이러스, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 파라인플루엔자 타입 1, 파라인플루엔자 타입 3, 및 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), SARS, 및 콕사키 바이러스 A, 콕사키 바이러스 B, 리노바이러스 및 에코바이러스를 포함하는 엔테로바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.제 24항에 있어서, 상기 인자는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종 및 클라미디아(Chlamydia) 종으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.제 24항에 있어서, 상기 인자는 적절한 디자인의 제1 및 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 적어도 하나의 포워드 혹은 리버스 수퍼 프라이머가 검출 수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 28항에 있어서, 상기 검출 수단은 화학적 요소, 효소적 요소, 형광 요소, 또는 방사능표지 요소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 1항에 있어서, 상기 표적 서열을 검출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 30항에 있어서, 검출 방법은 직접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.제 30항에 있어서, 검출 방법은a. 각 검출 올리고뉴클레오타이드 세트는 증폭 산물내 특이적 표적 서열을 바인딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 가지며 제1 신호 생성 수단을 포함하는 적어도 하나의 검출 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공하는 단계|b. 상기 검출 올리고뉴클레오타이드를 상기 제2 증폭 산물과 접촉 및 배양하는 단계|c. 상기 제1 신호 생성 수단을 자극하여 제1 신호를 생성하는 단계| 및d. 상기 제1 신호를 검출하는 단계|를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 32항에 있어서, 상기 제1 신호는 상기 인자에 독특하며 상기 제1 신호는 상기 인자를 확인하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 32항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 표지, 화학적 표지, 효소적 표지, 또는 방사능표지인 것을 특징으로 하는 방법.제 32항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 마이크로스피어인 것을 특징으로 하는 방법.제 31항에 있어서, 상기 방법은 간접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.적어도 하나의 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍 및 적어도 하나의 제1 표적 증폭 프라이머쌍을 포함하는 반응 혼합물에서 증폭을 수행하는 것을 포함하며, 상기 표적 증폭 프라이머는 FSP 및 RSP를 포함하며, 상기 방법은a. i) 주형으로서, 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 핵산|ii) 상기 핵산에 하이브리드되고 상기 표적 서열을 브라켓팅(bracketing)하며 각각은 5``말단에 표적 증폭 프라이머중 하나의 표적 서열에 상응하는 수퍼 프라이머 바인딩 태그를 포함하는 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍| 및iii) 제1 증폭 반응이 다수의 제1 증폭 산물을 생성하도록 하며, 여기서 상기 제1 증폭 산물의 적어도 일부가 상기 수퍼 프라이머 바인딩 태그의 적어도 하나의 컴플리먼트를 함유하여 이에 따라 적어도 하나의 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 형성하는 제1 증폭 반응을 위한 증폭 시약 및 조건|을 이용하는 제1 증폭 반응| 및b. i) 주형으로서, 상기 적어도 하나의 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 함유하는 제1 증폭 산물의 일부|ii) 상기 제1 증폭 산물의 일부상의 상기 수퍼 프라이머 바인딩 사이트에 바인딩하는 제1 표적 증폭 프라이머쌍| 및iii) 제2 증폭 반응이 상기 표적 서열을 함유하는 다수의 제2 증폭 산물을 생성하도록 하는 제2 증폭 반응을 위한 증폭 시약 및 조건|을 이용하는 제2 증폭 반응을 포함하는 적어도 하나의 표적 서열의 멀티플렉스 프라이머-기초 증폭 방법.제 37항에 있어서, 상기 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍은 Fi 및 Ri 프라이머를 포함하며 상기 제1 표적 증폭 프라이머쌍은 FSP 및 RSP를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 38항에 있어서, Fi상의 수퍼 프라이머 바인딩 태그는 FSP가 상기 Fi 프라이머상의 수퍼 프라이머 바인딩 태그의 컴플리먼트에 바인딩하도록 FSP의 서열과 일치하며 그리고 Ri상의 수퍼 프라이머 바인딩 태그는 RSP가 상기 Ri 프라이머상의 수퍼 프라이머 바인딩 태그의 컴플리먼트에 바인딩하도록 RSP의 서열과 일치하는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 각 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-40뉴클레오타이드, 10-30뉴클레오타이드 및 10-20뉴클레오타이드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 저농도로 존재하며 상기 표적 증폭 프라이머는 고농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.제 41항에 있어서, 상기 저농도는 0.002-0.2μM의 농도이며 상기 고농도는 0.2-1.0μM의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 프라이머는 표적 서열의 지수적 증폭에 충분하지 않은 농도로 존재하며 상기 표적 증폭 프라이머는 표적 서열의 지수적 증폭에 충분한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 각 표적 엔리치먼트 프라이머는 동일한 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 적어도 하나의 표적 엔리치먼트 프라이머는 다른 표적 엔리치먼트 프라이머보다 높은 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 각 표적 증폭 프라이머는 동일한 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 적어도 하나의 표적 증폭 프라이머는 다른 표적 증폭 프라이머보다 높은 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 47항에 있어서, 상기 보다 높은 농도의 표적 증폭 프라이머는 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 제1 증폭 반응 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하며 제2 증폭 반응 조건은 표적 증폭 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 49항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 공정은 증폭 조건, 92-94℃에서 0.5-1분, 50-55℃에서 1-2.5분 및 70-72℃에서 0.5-1분을 포함하며 그리고 상기 표적 증폭 공정은 증폭 조건, 94℃에서 15-30초, 50-55℃에서 15-30초 및 72℃에서 15-30초를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 제1 증폭 반응 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두 개의 완전 사이클 및 선택적인 증폭 공정의 적어도 두 개의 완전 사이클을 포함하며 그리고 제2 증폭 반응 공정 조건은 표적 엔리치먼트 공정의 적어도 두개의 완전 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 51항에 있어서, 상기 표적 엔리치먼트 공정은 증폭 조건, 92-94℃에서 0.5-1분, 50-55℃에서 1-2.5분 및 70-72℃에서 0.5-1분을 포함하며, 선택적 증폭 공정은 증폭 조건, 92-94℃에서 15-30초, 70-72℃에서 1-2분을 포함하며 그리고 상기 표적 증폭 공정은 증폭 조건, 94℃에서 15-30초, 50-55℃에서 15-30초 및 72℃에서 15-30초를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 52항에 있어서, 선택적인 증폭은 상기 수퍼 프라이머 바인딩 사이트를 함유하는 제1 증폭 산물을 생성하는 방향으로 편향된 것을 특징으로 하는 방법.제 52항에 있어서, 각 제1 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 10-20뉴클레오타이드이며 각 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍의 길이는 30-40뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 2이상의 표적 증폭 프라이머를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 상기 인자는 바이러스 및 박테리아로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 상기 인자는 아데노바이러스, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 파라인플루엔자 타입 1, 파라인플루엔자 타입 3, 및 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), SARS, 및 콕사키 바이러스 A, 콕사키 바이러스 B, 리노바이러스 및 에코바이러스를 포함하는 엔테로바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 상기 인자는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종 및 클라미디아(Chlamydia) 종으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 상기 인자는 적절한 디자인의 제1 및 제2 표적 엔리치먼트 프라이머쌍에 의해 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 적어도 하나의 포워드 혹은 리버스 수퍼 프라이머가 검출 수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 60항에 있어서, 상기 검출 수단은 화학적 요소, 효소적 요소, 형광 요소, 또는 방사능표지 요소로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 37항에 있어서, 상기 표적 서열을 검출하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 62항에 있어서, 검출 방법은 직접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.제 62항에 있어서, 검출 방법은a. 각 검출 올리고뉴클레오타이드 세트는 증폭 산물내 특이적 표적 서열을 바인딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 가지며 제1 신호 생성 수단을 포함하는 적어도 하나의 검출 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공하는 단계|b. 상기 검출 올리고뉴클레오타이드를 상기 제2 증폭 산물과 접촉 및 배양하는 단계|c. 상기 제1 신호 생성 수단을 자극하여 제1 신호를 생성하는 단계| 및d. 상기 제1 신호를 검출하는 단계|를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 64항에 있어서, 상기 제1 신호는 상기 인자에 독특하며 상기 제1 신호는 상기 인자를 확인하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 64항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 표지, 화학적 표지, 효소적 표지, 또는 방사능표지인 것을 특징으로 하는 방법.제 64항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 마이크로스피어인 것을 특징으로 하는 방법.제 62항에 있어서, 상기 방법은 간접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.a. 질병 인자 존재의 진단을 필요로 하는 대상자로부터 질병 인자를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 제공하는 단계|b. 상기 질병 인자의 표적 서열을 함유하는 핵산을 상기 시료로부터 분리하는 단계|c. 상기 핵산을 제 1항 또는 37항중 어느 항의 프라이머-기초 증폭 방법에 적용하는 단계|d. 상기 질병 인자로부터 상기 표적 서열을 검출하는 단계|를 포함하는 대상자에서 질병 인자의 존재를 진단하는 방법.제 69항에 있어서, 질병 인자는 바이러스 및 박테리아로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 69항에 있어서, 질병 인자는 아데노바이러스, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 파라인플루엔자 타입 1, 파라인플루엔자 타입 3, 및 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), SARS, 및 콕사키 바이러스 A, 콕사키 바이러스 B, 리노바이러스 및 에코바이러스를 포함하는 엔테로바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.제 69항에 있어서, 상기 질병 인자는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종 및 클라미디아(Chlamydia) 종으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.제 69항에 있어서, 검출 방법은 직접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.제 69항에 있어서, 검출 방법은a. 각 검출 올리고뉴클레오타이드 세트는 증폭 산물내 특이적 표적 서열을 바인딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 가지며 제1 신호 생성 수단을 포함하는 적어도 하나의 검출 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공하는 단계|b. 상기 검출 올리고뉴클레오타이드를 상기 제2 증폭 산물과 접촉 및 배양하는 단계|c. 상기 제1 신호 생성 수단을 자극하여 제1 신호를 생성하는 단계| 및d. 상기 제1 신호를 검출하는 단계|를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 74항에 있어서, 상기 제1 신호는 상기 질병 인자에 독특하며 상기 제1 신호는 상기 질병 인자를 확인하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 74항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 표지, 화학적 표지, 효소적 표지, 또는 방사능표지인 것을 특징으로 하는 방법.제 74항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 마이크로스피어인 것을 특징으로 하는 방법.제 68항에 있어서, 상기 방법은 간접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.a. 질병 인자 존재의 진단을 필요로 하는 대상자로부터 질병 인자 또는 이차 질병 인자를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 제공하는 단계|b. 상기 질병 인자 또는 이차 질병 인자 또는 두가지 모두의 표적 서열을 함유하는 핵산을 상기 시료로부터 분리하는 단계|c. 상기 핵산을 제 1항 또는 38항중 어느 항의 프라이머-기초 증폭 방법에 적용하는 단계|d. 상기 질병 인자 또는 이차 질병 인자 또는 두가지 모두로부터 상기 표적 서열을 검출하는 단계|를 포함하는 대상자에서 질병 인자 및 이차 질병 인자의 존재를 감별 진단하는 방법.제 79항에 있어서, 질병 인자 또는 이차 질병 인자는 바이러스 및 박테리아로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.제 79항에 있어서, 질병 인자 또는 이차 질병 인자는 아데노바이러스, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 파라인플루엔자 타입 1, 파라인플루엔자 타입 3, 및 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), SARS, 및 콕사키 바이러스 A, 콕사키 바이러스 B, 리노바이러스 및 에코바이러스를 포함하는 엔테로바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.제 79항에 있어서, 질병 인자 또는 이차 질병 인자는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종 및 클라미디아(Chlamydia) 종으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.제 79항에 있어서, 검출 방법은 직접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.제 79항에 있어서, 검출 방법은a. 각 검출 올리고뉴클레오타이드 세트는 증폭 산물내 특이적 표적 서열을 바인딩할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 가지며 제1 신호 생성 수단을 포함하는 적어도 하나의 검출 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공하는 단계|b. 상기 검출 올리고뉴클레오타이드를 상기 제2 증폭 산물과 접촉 및 배양하는 단계|c. 상기 제1 신호 생성 수단을 자극하여 제1 신호를 생성하는 단계| 및d. 상기 제1 신호를 검출하는 단계|를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제 84항에 있어서, 상기 제1 신호는 상기 질병 인자에 독특하며 상기 제1 신호는 상기 인자를 확인하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.제 84항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 표지, 화학적 표지, 효소적 표지, 또는 방사능표지인 것을 특징으로 하는 방법.제 84항에 있어서, 상기 제1 신호 생성 수단은 형광 마이크로스피어인 것을 특징으로 하는 방법.제 79항에 있어서, 상기 방법은 간접 검출 방법인 것을 특징으로 하는 방법.