주식회사 툴젠 / 서울특별시 관악구 신림동 산**-* 서울대학교 유전공학특화창업보육센터 *층
대리인 / 주소
이현실;
장성구
(Lee Hyun Sil)
서울시 서초구 양재동 ***-* 트러스트타워**층(제일광장특허법률사무소);
서울시 서초구 양재동 ***-* 트러스트타워**층(제일광장특허법률사무소)
심사진행상태
취하(심사미청구)
법적상태
취하
초록
키메릭 징크 핑거 단백질들, 및 원핵세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해 징크 핑거 단백질들을 사용하는 방법들이 본 명세서에서 기술된다.
대표청구항▼
하기 단계들을 포함하는, 원핵세포 내에서 유전자의 발현을 조절하는 방법:인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포를 제공하는 단계로서, 상기 인공 폴리펩타이드가 징크 핑거 도메인을 포함하고, 유전자 내 표적 DNA 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 단계| 및상기 인공 폴리펩타이드가 생산되고, 표적 DNA 부위에 결합하고, 유전자를 조절하는 조건 하에서 상기 세포 내에서 인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 발현시키는 단계.제1항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드가 세 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 것을 특징으로
하기 단계들을 포함하는, 원핵세포 내에서 유전자의 발현을 조절하는 방법:인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포를 제공하는 단계로서, 상기 인공 폴리펩타이드가 징크 핑거 도메인을 포함하고, 유전자 내 표적 DNA 부위에 결합하는 것을 특징으로 하는 단계| 및상기 인공 폴리펩타이드가 생산되고, 표적 DNA 부위에 결합하고, 유전자를 조절하는 조건 하에서 상기 세포 내에서 인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 발현시키는 단계.제1항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드가 세 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제1항에 있어서, 상기 유전자가 내생 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.제3항에 있어서, 두 개 이상의 내생 유전자의 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.제4항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드가 다시스트론성 RNA의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현이, 상기 인공 단백질의 부재 시 유전자의 발현에 비하여 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.제1항에 있어서, 상기 세포가 대장균 세포인 것을 특징으로 하는 방법.제1항에 있어서, 상기 조절이 대조 세포에 비하여 상기 세포의 특성을 변경시키는 것을 특징으로 하는 방법.제8항에 있어서, 상기 특성이 열 저항성 또는 용매 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.제3항에 있어서, 상기 내생 유전자가 디카복실라제 효소를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.제10항에 있어서, 상기 디카복실라제 효소가 유비퀴논 생합성 경로의 디카복실라제 효소인 것을 특징으로 하는 방법.제11항에 있어서,상기 효소가 ubiX 유전자 산물인 것을 특징으로 하는 방법.제1항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 발현이 조절가능한 것을 특징으로 하는 방법.제3항에 있어서, 상기 내생 유전자의 특성을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.제14항에 있어서, 상기 특성 분석이 상기 인공 폴리펩타이드에 의해 결합된 DNA를 동정하고, 결합된 DNA와 관련된 상기 내생 유전자의 염기서열을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제15항에 있어서, 상기 분리가 상기 DNA에 상기 인공 단백질을 교차-연결시키고, 상기 인공 단백질을 면역침전시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제15항에 있어서, 제2 유형의 세포 내에서 내생 유전자의 동족체를 동정하고, 상기 동족체의 발현을 조절하는 단계를 추가로 포함하는 방법.제17항에 있어서, 상기 제2 유형의 세포가 원핵세포인 것을 특징으로 하는 방법.제18항에 있어서, 상기 제2 유형의 세포가 세균 세포인 것을 특징으로 하는 방법.하기 단계를 포함하는 방법:복수개 각각의 세포가 인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 인공 폴리펩타이드가 징크 핑거 도메인을 포함하고, 상기 인공 폴리펩타이드가 상기 복수개의 세포들간에는 서로 다른, 복수개의 원핵세포들을 제공하는 단계| 및대조 세포에 비하여 변경된 특성을 갖는 세포를 상기 복수개의 세포들로부터 동정하는 단계.제20항에 있어서, 상기 특성이 유기용매에 대한 내성이고, 상기 동정이 유기용매에 복수개의 세포들을 노출시키고 상기 세포들의 생존율을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제20항에 있어서, 상기 특성이 내열성이고, 상기 평가가 상기 세포들을 열에 노출시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제20항에 있어서, 상기 동정된 세포로부터 상기 인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.제23항에 있어서, 상기 핵산의 서열을 분석하는 것을 추가로 포함하는 방법.제20항에 있어서, 상기 동정된 세포로부터 상기 인공 폴리펩타이드를 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.제20항에 있어서, 상기 동정된 세포로부터 상기 인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 분리하고, 제2 복수개의 세포들 내로 상기 핵산을 도입하고, 상기 인공 폴리펩타이드가 생산되는 조건 하에서 상기 제2 복수개의 세포들을 배양하고, 대조 세포에 비하여 변경된 특성을 갖는 제2 복수개의 세포를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.제20항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드의 표적 DNA 부위의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.제20항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드에 의해 결합된 내생 유전자를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.제20항에 있어서, 상기 세포의 하나 이상의 유전자들의 발현을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.제28항에 있어서, 제2 세포 내에서 상기 내생 유전자의 발현을 변경시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.제20항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드가 적어도 세 개의 징크 핑거 도메인들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.제31항에 있어서, 상기 징크 핑거 도메인들이 효모 징크 핑커 도메인들 또는 그의 변형체들인 것을 특징으로 하는 방법.제20항에 있어서, 상기 변경된 특성을 이용하기 위하여 상기 동정된 세포를 배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.인공 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포로서, 상기 인공 폴리펩타이드가 징크 핑거 도메인을 포함하고, 상기 핵산이 발현되는 조건 하에서 상기 인공 폴리펩타이드가 유전자 내 표적 DNA 부위에 결합하여 상기 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 원핵세포.제34항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드가 내생 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 원핵세포.제34항에 있어서, 상기 인공 폴리펩타이드가 세 개 이상의 징크 핑커 도메인들을 포함하는 것을 특징으로 하는 원핵세포.제35항에 있어서, 상기 유전자가 디카복실라제인 것을 특징으로 하는 방법.제20항의 방법에 의해 선별된 세포.한 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 징크 핑거 도메인의 위치 -1, +2, +3 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 RSHR, HSSR, ISNR, RDHT, QTHR, VSTR, QNTQ, 및 CSNR로부터 선택된 모티프에 상응하고, 상기 폴리펩타이드가 내생 원핵세포 유전자를 조절하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제39항에 있어서, 제2 및 제3 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 및 제3 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 RSHR, HSSR, 및 ISNR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제39항에 있어서, 제2 및 제3 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 및 제3 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 ISNR, RDHT, 및 QTHR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제41항에 있어서, 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제4 도메인의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 모티프 VSTR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제39항에 있어서, 제2 및 제3 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 및 제3 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 QNTQ, CSNR, 및 ISNR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.한 개 이상의 징크 핑거 도메인을 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 징크 핑거 도메인의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 QSHV, VSNV, QSNK, RDHT, QTHR, QSSR, WSNR, VSNV, RSHR, DSAR, QTHQ, RSHR, QSNR, 및 CSNR로부터 선택된 모티프에 상응하고, 상기 폴리펩타이드가 내생 원핵세포 유전자를 조절하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 QSHV, VSNV, QSNK, 및 QSNK에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 RDHT, QSHV, QTHR, 및 QSSR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 WSNR, QSHV, VSNV, 및 QSHV에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 QTHR, RSHR, QTHR, 및 QTHR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 DSAR, RDHT, QSHV, 및 QTHR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 QTHQ, RSHR, QTHR, 및 QTHR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 QSHV, VSNV, QSNR, 및 CSNR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 VSNV, QTHR, QSSR, 및 RDHT에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 RDHT, QSHV, QTHR, 및 QSNR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제44항에 있어서, 제2, 제3, 및 제4 징크 핑거 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 도메인들의 위치 -1, +2, +3, 및 +6에서 DNA 접촉 잔기들이 각각 모티프 DSAR, RDHT, QSNK, 및 QTHR에 상응하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.제39항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산.제39항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세균 발현 벡터.
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