초록 ▼

본 발명은 초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system) 및 이를 이용한 정량적 세포 분석방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 초분광 이미지 시스템은 공초점 현미경(confocal microscope)에 시간에 따라 투과될 수 있는 빛의 파장을 연속적으로 변환시킬 수 있는 가변형 필터(tunable filter)를 부착시킨 광학시스템과 이미지를 취득(image acquisition)하고 분석하는 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템으로 구성되어 있다. 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하여 경미하게 초점을 흐

본 발명은 초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system) 및 이를 이용한 정량적 세포 분석방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 초분광 이미지 시스템은 공초점 현미경(confocal microscope)에 시간에 따라 투과될 수 있는 빛의 파장을 연속적으로 변환시킬 수 있는 가변형 필터(tunable filter)를 부착시킨 광학시스템과 이미지를 취득(image acquisition)하고 분석하는 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템으로 구성되어 있다. 상기 초분광 이미지 시스템을 이용하여 경미하게 초점을 흐린 이미지(unfocussed image)를 얻고 배경 보정을 한 뒤 이미지 속 모든 세포에 대한 역치 매개변수들(threshold parameters)를 걸어주고 부위 선별을 하게 되면 전체 이미지 속에서 역치 매개변수를 만족시키는 모든 세포를 자동적으로 선택할 수 있어서 얻을 수 있어 이미지 속 모든 세포들을 정량적으로 계수(count) 할 수 있어 정량적인 세포 생존능력 분석(quantitative cell viability), 약물 스크리닝(drug screening) 또는 유세포 분석 (Flow cytometric analysis)에 유용하게 이용될 수 있다.

대표청구항 ▼

이미지 취득(image acquisition) 및 분석 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템이 설치된 공초점 현미경(confocal microscope)에 시간에 따라 투과되는 빔의 파장을 조절할 수 있는 가변형 필터(tunable filter)를 접목시킨 초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system).제 1항에 있어서, 샘플을 놓는 플랫폼; 이온 레이저 빔을 방출하는 이온 레이저 광원 또는 필터를 채용한 백색광원;상기 이온 레이저 광원 또는 상기 백색광원으로부터 방출된 입사광의 입사량을 줄이는 ND(neut

이미지 취득(image acquisition) 및 분석 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템이 설치된 공초점 현미경(confocal microscope)에 시간에 따라 투과되는 빔의 파장을 조절할 수 있는 가변형 필터(tunable filter)를 접목시킨 초분광 이미지 시스템(hyperspectral imaging system).제 1항에 있어서, 샘플을 놓는 플랫폼; 이온 레이저 빔을 방출하는 이온 레이저 광원 또는 필터를 채용한 백색광원;상기 이온 레이저 광원 또는 상기 백색광원으로부터 방출된 입사광의 입사량을 줄이는 ND(neutal density) 필터;상기 ND 필터를 통과한 입사광을 정제하는 간섭필터(interference filter);상기 간섭필터를 통과한 입사광을 대물렌즈 방향으로 반사하고 대물렌즈로부터 모아진 형광빔을 통과시키는 이색 반사경(dichromatic mirror); 입사광의 초점을 맞추고 상기 샘플로부터 여기된 형광빔을 모으는 대물렌즈;상기 이색 반사경을 통과한 형광빔을 반사하는 프리즘;상기 프리즘을 통과한 형광빔의 직경을 줄이는 렌즈;상기 렌즈를 통과한 형광빔의 파장을 시간에 따라 조절할 수 있는 가변형 필터;상기 가변형 필터를 통과한 빔의 흩어지는 것을 방지하는 롱-패스 필터(long-pass filter);상기 롱-패스 필터를 통과한 형광빔을 검출하는 CCD 카메라; 및상기 CCD 카메라에 의해 검출한 형광빔의 이미지 취득 및 분석 소프트웨어를 갖춘 컴퓨터 시스템으로 이루어진 초분광 이미지 시스템. 제 1항 또는 제 2항 있어서, 가변형 필터는 음향광학 파장 가변형 필터(Acousto-Optic Tunable Filter, AOTF) 또는 액정 가변형 필터(Liquid crystal tunable filter, LCTF)인 것을 특징으로 하는 초분광 이미지 시스템.제 3항에 있어서, 음향광학 파장 가변형 필터(Acousto-Optic Tunable Filter, AOTF)는 463 nm ~ 근 적외광에 이르는 스펙트럼 부위를 0.1 ~ 30 nm 파장 간격으로 초당 하나의 이미지 프레임으로 스캐닝하는 것을 특징으로 하는 초분광 이미지 시스템.1) 공초점 현미경의 샘플 플랫폼에 세포시료를 올려놓은 다음, 대물렌즈의 높이를 조절하여, 초점을 맞춘 이미지 및 초점을 경미하게 흐린 이미지를 CCD 카메라를 통해 취득하고 배경 보정을 위하여 배지만 포함된 배지시료에 대한 이미지를 CCD 카메라를 통해 취득하여 상기 공초점 현미경에 연결된 컴퓨터 시스템을 이용하여 파일로 저장하는 단계;2) 상기 단계 1)을 통해 저장된 파일을 상기 컴퓨터 시스템에 탑재된 이미지 분석 소프트웨어를 통해 로딩한 후, 상기 초점을 경미하게 흐린 이미지에 대한 배경보정을 수행하는 단계;3) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 1)에서 배경보정된 이미지에 대하여 역치 조정을 수행하는 단계;4) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 3)에서 역치 조정된 이미지로부터 원하지 않는 물체를 제거하는 단계;5) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 4)에서 원하지 않는 물체가 제거된 이미지로부터 원하는 물체인 세포의 이미지 형성을 위한 가상(mask)을 형성하는 단계;6) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 단계 5)의 가상으로부터 세포 주변 이미지를 형성하는 단계; 및7) 상기 이미지 분석 소프트웨어를 통해 상기 세포 주변 이미지를 이용하여 세포수를 계수하는 단계를 포함하는 세포 분석방법.제 5항에 있어서, 분석대상 세포수는 300 내지 2000개인 것을 특징으로 하는 분석방법.제 5항에 있어서, 세포사멸 및 세포괴사를 동시에 모니터하는 것을 특징으로 하는 분석방법.제 5항에 있어서, 상대적인 형광 강도를 이용하여 세포자살 및 세포괴사의 형태 감별을 하는 것을 특징으로 하는 분석방법.제 5항에 있어서, 3차원(3D)적 시각화 효과를 이용하여 세포자살 및 세포괴사의 형태 감별을 하는 것을 특징으로 하는 분석방법.제 5항에 있어서, 이미지 분석 소프트웨어는 메타모프®(MetaMorph®)인 것을 특징으로 하는 분석방법.제 5항에 있어서, 상기 공초점 현미경은 제 1항의 이미지 분석 시스템인 것을 특징으로 하는 분석방법.제 5항에 있어서, 원하지 않는 물체의 제거는 이미지의 너비 감소 또는 밝기를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 분석방법.제 5항에 있어서, 세포수의 계수는 광학 밀도(optical density), 평균 그레이 값(average gray value), Z 위치(Z 위치), 각(angle), 거리(distance), 부위(area), 너비(width), 경과 시간(elapsed time), 단계 레벨(stage label), 파장(wavelength), 부위 레벨(region level), 강도(intensity S/N), 역치 부위(threshod area)로 이루어진 군으로부터 선택되는 매개변수를 이용하는 것을 특징으로 하는 분석방법.1) 세포에 세포죽음 경로를 유도하는 시약을 처리하는 단계;2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소로 염색시키는 단계; 및3) 상기 제 5항의 분석방법으로 전체 세포수 및 죽은 세포수를 계수하는 단계를 포함하는 세포 생존능력 분석방법(cell viability assay).제 14항에 있어서, 세포는 백혈병 세포인 HL-60인 것을 특징으로 하는 세포 생존능력 분석방법.제 14항에 있어서, 상기 단계 1)의 세포죽음 경로를 유도하는 시약은 살리실산나트륨(sodium salicylate), 나린제닌(naringenin) 또는 캄토테신(camptothecin)인 것을 특징으로 하는 세포 생존능력 분석방법.제 14항에 있어서, 상기 단계 2)의 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)이고 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)인 것을 특징으로 하는 세포 생존능력 분석방법.1) 세포에 세포죽음 경로를 유도하는 시약 및 피검 물질을 처리하는 단계;2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소로 염색시키는 단계; 3) 상기 제 5항의 분석방법으로 전체 세포수와 죽은 세포수를 계수하는 단계; 및4) 피검 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 죽은 세포수가 감소된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 세포사멸 억제제의 스크리닝방법.제 18항에 있어서, 상기 단계 1)의 세포는 백혈병 세포인 HL-60인 것을 특징으로 하는 스크리닝방법.제 18항에 있어서, 상기 단계 1)의 세포죽음 경로를 유도하는 시약은 살리실산나트륨(sodium salicylate), 나린제닌(naringenin) 또는 캄토테신(camptothecin)인 것을 특징으로 하는 스크리닝방법.제 18항에 있어서, 상기 단계 2)의 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)이고 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)인 것을 특징으로 하는 스크리닝방법.1) 세포를 형광성 색소로 염색시키는 단계; 및2) 상기 제 5항의 분석방법으로 형광성 색소로 염색된 세포를 계수하는 단계를 포함하는 유세포 분석방법.제 22항에 있어서, 형광성 색소는 세포사멸에 특이적인 형광성 색소 및/또는 세포괴사에 특이적인 형광성 색소인 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.제 23항에 있어서, 상기 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)인 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.제 23항에 있어서, 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물인 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.제 22항에 있어서, 세포는 두 가지 이상의 항체로 표지된 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법. 1) 세포에 피검 물질을 처리하는 단계; 2) 상기 세포를 세포괴사 또는 세포사멸에 특이적인 형광 색소로 염색하는 단계; 3) 상기 제 5항의 분석방법으로 전체 세포수와 죽은 세포수를 계수하는 단계; 및4) 피검 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 죽은 세포수가 증가된 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 세포괴사 또는 세포사멸 촉진제의 스크리닝방법.제 27항에 있어서, 세포괴사에 특이적인 형광성 색소는 프로피디움 요오드화물인 것을 특징으로 하는 스크리닝방법제 27항에 있어서, 상기 세포사멸에 특이적인 형광성 색소는 Qdot-스트렙타비딘 결합물(Qdot-streptavidin conjugate)인 것을 특징으로 하는 유세포 분석방법.