오스트리안 리서치 센터 게엠베하-에알씨 / 오스트리아 비엔나 도나우-씨티-스트라쎄 * (우: ****)
대리인 / 주소
강명구
(KANG, Myung Koo)
서울특별시 종로구 당주동 *번지 로얄빌딩 ****호 (강명구 특허법률사무소)
심사진행상태
거절결정(일반)
법적상태
거절
초록▼
체액 샘플 내에서 미생물 병원균을 확인하는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: a) 체액 샘플을 제공하는 단계; b) 미생물 병원균을 용해시키고, 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계, 이런 단계 동안 또는 이런 단계 이후에 이들 증폭된 핵산은 표지되고; c) 단계 b)의 표지된 증폭된 핵산을 마이크로어레이의 표면상에 한정된 구역에서, 미생물 병원균으로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브를 포함하는 마이크로어레
체액 샘플 내에서 미생물 병원균을 확인하는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: a) 체액 샘플을 제공하는 단계; b) 미생물 병원균을 용해시키고, 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계, 이런 단계 동안 또는 이런 단계 이후에 이들 증폭된 핵산은 표지되고; c) 단계 b)의 표지된 증폭된 핵산을 마이크로어레이의 표면상에 한정된 구역에서, 미생물 병원균으로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브를 포함하는 마이크로어레이와 접촉시키는 단계; d) 마이크로어레이에 특이적으로 결합되는 표지된 증폭된 핵산을 탐지함으로써, 프로브에 대한 하나이상의 종류의 표지된 증폭된 핵산의 결합을 탐지하는 단계; e) 표지된 증폭된 핵산의 탐지된 결합을, 미생물 병원균으로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브의 한정된 구역과 상관시킴으로써 체액 샘플 내에서 미생물 병원균을 확인하는 단계.
대표청구항▼
체액 샘플 내에서 미생물 병원균을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: a) 체액 샘플을 제공하는 단계; b) 미생물 병원균을 용해시키고, 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계, 이런 단계 동안 또는 이런 단계 이후에 이들 증폭된 핵산은 표지되고; c) 단계 b)의 표지된 증폭된 핵산을 마이크로어레이의 표면상에 한정된 구역에서, 미생물 병원균으로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브를 포함하는 마
체액 샘플 내에서 미생물 병원균을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: a) 체액 샘플을 제공하는 단계; b) 미생물 병원균을 용해시키고, 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계, 이런 단계 동안 또는 이런 단계 이후에 이들 증폭된 핵산은 표지되고; c) 단계 b)의 표지된 증폭된 핵산을 마이크로어레이의 표면상에 한정된 구역에서, 미생물 병원균으로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브를 포함하는 마이크로어레이와 접촉시키는 단계; d) 마이크로어레이에 특이적으로 결합되는 표지된 증폭된 핵산을 탐지함으로써, 프로브에 대한 하나이상의 종류의 표지된 증폭된 핵산의 결합을 탐지하는 단계; e) 표지된 증폭된 핵산의 탐지된 결합을, 미생물 병원균으로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브의 한정된 구역과 상관시킴으로써 체액 샘플 내에서 미생물 병원균을 확인하는 단계. 청구항 1에 있어서, 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA 상에서 핵산 증폭 반응은 PCR 반응으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 또는 2에 있어서, 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA 상에서 핵산 증폭 반응은 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 포괄적 프라이머, 바람직하게는, 8개 이하의(4개의 정방향, 4개의 역방향) 프라이머, 더욱 바람직하게는, 6개 이하의(3개의 정방향, 3개의 역방향) 프라이머, 바람직하게는, 4개 이하의(2개의 정방향, 2개의 역방향) 프라이머로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 3중 어느 한 항에 있어서, 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA 상에서 핵산 증폭 반응은 Seq. ID No. 1, 2, 4와 5에 따른 프라이머, 바람직하게는, GoTaq® 또는 FirePol® DNA 중합효소로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. 청구항 1 내지 4중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)와 단계 b) 사이에 여과 단계가 수행되고, 여기서 샘플은 체액 샘플, 바람직하게는, 혈액 샘플 내에 존재하는 백혈구를 보유하지만 미생물 병원균을 보유하지 않는 필터를 통하여 여과되는 것을 특징으로 하는 방법. 청구항 1 내지 5중 어느 한 항에 있어서, 미생물 병원균은 인간 병원균인 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 6중 어느 한 항에 있어서, 핵산의 표지화(labelling)는 프라이머 신장, 시험관내 전사, 비오틴-스트렙타비딘-표지화, 등온 Klenow 단편 기초된 표지화 또는 직접적인 핵산 증폭 표지화, 바람직하게는, 직접적인 PCR 표지화에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 7중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 표지된 핵산은 핵산 증폭 반응 이후에 정제 또는 세척 단계 없이 마이크로어레이에 직접적으로 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 8중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이는 아래의 미생물 병원균: 대장균(Escherichia coli) (ATCC 35218, EC5, EC17, 81617, 68933, 68307), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) (DSMZ 30053, 12676), 엔테로박터 클로에이시(Enterobacter cloacae) (26385, 79232, 93840, 12720, 74892), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae) (25809, 85813, 26385, 13253), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) (26785, 26384, 73739, 26786, 96633), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) (DSMZ 4595), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii) (80324, 73489), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) (ATCC 6538, ATCC 25923, ATCC 29213, 83799, 82913, 73237, 12998), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis) (ATCC 14990, 73711, 35989, 80320, 13000, 77504, 79510), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) (ATCC 29212, EF4, 81239, 83776, 27520), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) (DSMZ 20477), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae) (DSMZ 25500), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)(ATCC 19615, 10388), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) (26786, ATCC 14153, 27761, 97656, 71913), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) (DSMZ 13387, 80196), 세라티아 마케스센스(Serratia marcescens) (DSMZ 30121), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii) (DSMZ 6675, 12615), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) (26178, 12950, 26535, 68961, 74352), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) (DSMZ 50170, 26394, 26396), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) (DSMZ 30007), 아시네토박터 엘워피(Acinetobacter lwoffii) (DSMZ 2403, 75496), 아시네토박터 라디오레시스텐스(Acinetobacter radioresistens) (DSMZ 6976), 아시네토박터 존소닐(Acinetobacter johnsonii) (DSMZ 6963), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (ATCC 10231, 21179, 27184, 96917, 96635), 칸디다 파라실로시스(Candida parapsilosis) (4344) 중에서 최소한 10개, 바람직하게는, 최소한 15개, 특히, 최소한 20개로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 9에 있어서, 마이크로어레이는 대장균(Escherichia coli), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로에이시(Enterobacter cloacae), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 세라티아 마케스센스(Serratia marcescens), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 엘워피(Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 라디오레시스텐스(Acinetobacter radioresistens), 아시네토박터 존소닐(Acinetobacter johnsonii), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 파라실로시스(Candida parapsilosis)의 최소한 10개의 상이한 종, 바람직하게는, 최소한 15개의 상이한 종, 특히, 최소한 20개의 상이한 종 중에서 최소한 한가지 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 10중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이는 다중특이적인 부동된 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 11중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이는 최소한 10개, 바람직하게는, 최소한 20개, 더욱 바람직하게는, 최소한 30개, 특히, 최소한 40개의 다중특이적 부동된 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 12중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이에 부동된 프로브의 최소한 20%, 바람직하게는, 최소한 40%, 특히, 최소한 50%는 다중특이적 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 13중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)의 상관은 마이크로어레이의 표면에 부동된 다중특이적 프로브에 대한 표지된 핵산의 결합 정보를 이용함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 14에 있어서, 단계 e)의 상관은 가중된 미스매치(weighted mismatch)와의 예측된 혼성화 패턴을 이용함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 15중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이는 최소한 5개, 바람직하게는, 최소한 10개, 더욱 바람직하게는, 최소한 20개, 이보다 더욱 바람직하게는, 최소한 30개, 특히, 최소한 50개의 Seq. ID No 6 내지 80에 따른 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 16중 어느 한 항에 있어서, 마이크로어레이 상에서 프로브는 패혈증과 연관되거나 연관된 것으로 의심되는 미생물 병원균, 특히, 세균 병원균의 최소한 80%, 바람직하게는, 최소한 90%, 더욱 바람직하게는, 최소한 95%, 특히, 최소한 98%를 대표하도록 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 17중 어느 한 항에 있어서, 미생물 병원균은 혈류 감염성이고, 체액 샘플은 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.청구항 1 내지 16중 어느 한 항에 있어서, 병원균은 질증(vaginosis) 병원균이고, 체액 샘플은 질액(vaginal fluid) 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.청구항 19에 있어서, 마이크로어레이는 최소한 5개, 바람직하게는, 최소한 10개, 더욱 바람직하게는, 최소한 20개, 이보다 더욱 바람직하게는, 최소한 30개, 특히, 최소한 50개의 Seq. ID No 81 내지 138에 따른 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 19 또는 20에 있어서, 마이크로어레이는 아래의 미생물 병원균: 가드넬라 바지날리스(Gardnerella vaginalis), 아토포비움(Atopobium), 모빌룬쿠스(Mobiluncus)와 박테로이드(Bacteroides) 중에서 최소한 1개, 바람직하게는, 최소한 2개, 특히, 최소한 3개로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.체액 샘플 내에서 미생물 병원균을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: a) 체액 샘플(이런 미생물 병원균을 보유하는 것으로 의심되는)을 제공하는 단계; b) 미생물 병원균(존재하면)을 용해시키고, 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA 상에서 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; c) 단계 b)의 증폭된 핵산을 마이크로어레이의 표면상에 한정된 구역에서, 미생물 병원균으로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브를 포함하는 마이크로어레이와 접촉시키는 단계;d) 부동된 프로브에 대한 증폭된 핵산의 결합 현상을 탐지하는 마이크로어레이 장치로 마이크로어레이에 특이적으로 결합되는 증폭된 핵산을 탐지함으로써, 프로브에 대한 하나이상의 종류의 증폭된 핵산의 결합을 탐지하는 단계;e) 증폭된 핵산의 탐지된 결합을, 미생물 병원균으로부터 16S 또는 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA에 대한 부동된 프로브의 한정된 구역과 상관시킴으로써 체액 샘플 내에서 미생물 병원균을 확인하는 단계.청구항 22에 있어서, 표지된 증폭된 핵산 대신에 비-표지된 핵산이 적용되는 점을 제외하고, 청구항 2 내지 21중 어느 한 항에 정의된 특정 구체예가 적용되는 것을 특징으로 하는 방법. 청구항 1 및 9 내지 23중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 마이크로어레이.혈액 샘플에 대한 샘플 유지 수단, 청구항 24에 따른 마이크로어레이 및 선택적으로, 청구항 1 내지 4중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 프라이머를 포함하는 검사 키트.청구항 25에 있어서, 청구항 1, 9, 10, 18, 19와 21중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 병원균의 16S와 18S rRNA를 인코딩하는 미생물 DNA의 증폭에 특이적인 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 키트.혈액 샘플 내에서 혈류 감염의 미생물 병원균을 확인하기 위한, 특히, 패혈증 환자 또는 패혈증이 발병할 위험이 있는 환자의 혈액을 모니터하기 위한, 청구항 18에서 청구항 24에 따른 마이크로어레이, 또는 청구항 25 또는 26에 따른 검사 키트의 용도. 질액 샘플 내에서 질증의 미생물 병원균의 확인을 위한, 청구항 19에서 청구항 24에 따른 마이크로어레이, 또는 청구항 25 또는 26에 따른 검사 키트의 용도. 병원균을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:a) 병원균의 뉴클레오티드 물질, 바람직하게는, DNA 또는 RNA, 특히, 16S rRNA 또는 18S rRNA의 탐지된 결합 현상의 신호 데이터의 매트릭스를 병원균에 특이적인 프로브에 제공하는 단계;b) 매트릭스를 변위치 표준화(quantile normalization)시키는 단계; c) k-최인접 이웃 알고리즘(k-nearest neighbour algorithm)으로 신호 데이터를 분류하는 단계, 여기서 바람직하게는 k=1이다.청구항 29에 있어서, 매트릭스는 최소한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 14개, 16개, 18개, 또는 20개 병원균의 신호 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 29 또는 20에 있어서, 결합 현상의 최소한 2개, 바람직하게는, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 신호 데이터가 매트릭스 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.청구항 29 내지 31중 어느 한 항에 있어서, 분류자(classifier)는 교차-검증(cross-validation) 방법, 특히, leave-one-out 방법으로 단계 d)에서 검증되는 것을 특징으로 하는 방법.
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