초록

본 발명자들은 조절화된 세포 배양 배지를 제조하는 방법, 하기의 단계를 포함하는 방법을 기술한다: (a) 중간엽 줄기세포(MSC), 이들의 후손 또는 세포 배양배지에서 이들로부터 유래된 세포주를 배양; 및 (b) 선택적으로 세포 배양 배지를 분리; 여기서 중간엽 줄기세포(MSC)는 FGF2를 포함하는 무혈청배지에서 공동배양의 부재시 배아줄기(ES)세포 콜로니 또는 이들의 후손을 분산시켜 수득된 세포를 증식시킴으로써 수득된다.

대표청구항 ▼

(a) 중간엽 줄기세포(MSC), 이들의 후손 또는 세포 배양배지에서 이들로부터 유래된 세포주를 배양; 및 (b) 선택적으로 세포 배양 배지를 분리;로 구성된 조절화된 세포 배양배지를 제조하는 방법에 있어서,상기 중간엽 줄기세포(MSC)는 FGF2를 포함하는 무혈청배지에서 공동배양의 부재시 배아줄기(ES)세포 콜로니 또는 이들의 후손을 분산시켜 수득된 세포를 증식시킴으로써 수득됨을 특징으로 하는 조절화된 세포 배양배지의 제조하는 방법제 1항에 있어서, 배아줄기세포 콜로니는 인간 배아줄기세포콜로니(hESC), 바람직하게는 배상체임을

(a) 중간엽 줄기세포(MSC), 이들의 후손 또는 세포 배양배지에서 이들로부터 유래된 세포주를 배양; 및 (b) 선택적으로 세포 배양 배지를 분리;로 구성된 조절화된 세포 배양배지를 제조하는 방법에 있어서,상기 중간엽 줄기세포(MSC)는 FGF2를 포함하는 무혈청배지에서 공동배양의 부재시 배아줄기(ES)세포 콜로니 또는 이들의 후손을 분산시켜 수득된 세포를 증식시킴으로써 수득됨을 특징으로 하는 조절화된 세포 배양배지의 제조하는 방법제 1항에 있어서, 배아줄기세포 콜로니는 인간 배아줄기세포콜로니(hESC), 바람직하게는 배상체임을 특징으로 하는 방법.제 1항 또는 제 2항에 있어서, 배아줄기세포콜로니는 트립신으로 분산됨을 특징으로 하는 방법제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 방법은 세포를 밖으로 플레이트 하기 전에 트립신으로 인간 배아줄기세포(hESC), 바람직하게는 배상체의 융합성 플레이트를 분산시킴을 포함함을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 공동배양의 부재는 영양세포층 없이 세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 배양 기질, 바람직하게는 젤라틴화된 플레이트 상에서 증식됨을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청배지는 약 5ng/ml의 농도에서 FGF2를 포함함을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청배지는: (i) 바람직하게는 약 5ng/ml의 농도에서 PDGF AB, 및 (ii) 바람직하게는 약 5∼10ng/ml의 농도에서 EGF의 하나 또는 모두를 포함함을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청배지는 혈청 대체 배지로 보충됨을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 트립신화에 의해 융합시 1 :4 로 분열됨을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 더욱이 세포표면 마커의 발현을 기초로 하여 증식된 세포로부터 중간엽 줄기세포를 선별하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법제 11항에 있어서, 중간엽 줄기세포는: ANPEP(CD13;LAPl;PEPN;gpl50:NM_0Ol150.1); ENG(END;ORW;HHT1;ORW1;CD105:NM_OO0l18.1); SCN9A(PN1;NE-NA:NM_002977.1); TRPV2 (VPvL;VPvLl;VRL-1;MGC12549:NM_016113.3); RAMPl(:NM_005855.1); F2RL2(PAR3:NM_004101.2); NTSRl(NTR:NM_002531.1); GABRA2(:NM_000807.1); SLC16A4(MCT4:NM_004696.1); ITGA4(CD49D:NM_000885.2); NCAM2(NCAM21;MGC51008: NM_004540.2); ILlRl(P80;ILlR;ILlRA;CD121A;D2S1473;IL-lR-alpha:NM_000877.2); PDGFRA(CD140A;PDGFR2:NM_006206.2); VCAMl(INCAM-100:NM_080682.1); SSFA2 (CS1;CS-1;KRAP;SPAG13;KIAA1927:NM_006751.3); TRHDE(PAP-II:NM_013381.1); EDG2 (LPAl;edg-2;vzg-l;Gpcr26;Mrecl.3;rec.l.3:NM_001401.3); NT5E(eN;NT5;NTE;eNT;CD73;E5NT:NM_002526.1); 및 FLRT2(KIAA0405:NM_013231.2); FAP(FAPA;DPPIV;SEPRASE: NM_004460.2)로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 표면 마커의 상승된 발현으로 세포를 선별함으로써 수득됨을 특징으로 하는 방법제 11항 또는 제 12항에 있어서, 표면 마커는 CD105를 포함함을 특징으로 하는 방법(수탁번호: NM_OO0l18.1)제 11항 또는 제 12항에 있어서, 표면 마커는 CD73을 포함함을 특징으로 하는 방법(수탁번호: NM_002526.1)제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기세포는: ITGB1BP3(MIBP:NM_014446.1); PTPRZl(PTPZ;HPTPZ;PTP18;PTPRZ;RPTPB:NM_002851.1); CNTNl(F3;GP135:NM_1 75038.1); PCDHl(PC42;PCDH42;MGC45991:NM_002587.3); PODXL(PCLP;Gp200: NM_005397.2); GPR64(HE6;TM7LN2:NM_005756.1); PROMl(AC133;CD133;PROML1:NM_006017.1); GPRC5C(RAIG3;RAIG-3:NM_022036.2); CD24 (CD24A:NM_013230.1); CLDN3(RVP1;HRVP1;CPE-R2;CPETR2:NM_001306.2); TACSTDl(EGP;KSA;M4Sl;MK-l;EGP40;MIC18;TROPl;Ep-CAM;hEGP-2;CO17-lA;GA733-2:NM_002354.1); HTR3A(HTR3:NM_000869.1); FGFR4(TKF;JTK2:NM_022963.1); ADCYl(: NM_021116.1); FGFR3(ACH;CEK2;JTK4;HSFGFR3EX:NM_022965.1); IL17RB(CRL4;EVI27;IL17BR;IL17RH1;MGC5245:NM_018725.2); SORLl(LRl l;LRP9;SORLA;gp250;SorLA-l:NM_003105.3); GPM6B(M6B:NM_005278.2); KCNS3(KV9.3;MGC9481:NM_002252.3); 및 FZD3 (Fz-3;hFz3:NM_017412.2)로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 감소된 발현을 지니는 세포를 선별함으로써 수득됨을 특징으로 하는 방법제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 마커는 CD24를 포함함을 특징으로 하는 방법(수탁번호: NM_013230.1)제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기세포는 CD 105+ CD24-인 세포에 대해 선별됨으로써 수득됨을 특징으로 하는 방법제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기세포는 표면항원에 대항하는 항체로 세포를 표지함으로써 선택되며, 바람직하게는, 형광활성 세포분류기(FACS) 또는 자성세포분류기(MACS)에 의해 선택됨을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 35 세대보다 적게 계대접종되며, 바람직하게는 세포는 약 14일, 바람직하게는 약 7일 동안 증식됨을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 배아줄기세포(hESC) 콜로니는 huES9 콜로니 또는 Hl ESC 콜로니를 포함함을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 세포 배양은 huES9.El, huES9.E3 또는 Hl. E2를 포함함을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 조절화된 세포 배지는 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 실시예 바람직하게는 실시예 9, 13, 14 또는 14A 중 어느 하나에 개시된 폴리펩티드의 전부를 포함함을 특징으로 하는 방법제 1항 내지 제 22항에 따르는 방법에 의해 수득될 수 있는 조절배지제 23항에 따르는 조절배지와 함께 약제학적으로 받아들일 수 있는 부형제, 희석제 또는 운반체를 포함하는 의약 성분 제 23항에 있어서, 질병 치료 방법의 사용에 관한 조절배지질병 치료에 대한 의약 성분의 제조에 관한 제 23항의 조절배지의 사용개체의 질병 치료의 방법에 관한 제 23항의 조절배지의 사용실시예 바람직하게는 실시예 9, 13, 14 또는 14A 중 어느 하나에 개시된 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상 또는 이들의 결합, 바람직하게는 대체로 전부를 포함하는 성분 개체의 질병 치료의 방법에 관한 제 28항의 성분의 사용심부전증, 골수 질병, 피부병, 화상 및 당뇨병, 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 암과 같은 퇴행성 질병으로 구성된 군에서 선택된 질병을 위한 제 25항에 따르는 조절배지, 제 26항에 따르는 조절배지의 사용 또는 제 27항 또는 제 29항에 따르는 사용심근경색증, 피부 상처, 피부 장애, 피부 손상, 피부염, 건선, 콘딜로마, 사마귀, 혈관종, 켈로이드, 피부암, 아토피피부염, 베체트병, 만성육아종병, 피부 T 세포 림프종, 궤양형성, 섬유증 및 기능의 손실을 포함하는 만성 조직 리모델링을 일으키는 염증 및 면역조절 곤란을 유도하는 초기 손상에 의해 특성화된 병리학적인 상태, 신장 허혈 부상, 낭성섬유증, 축농증 및 비염 또는 정형외과적 질병으로 구성된 군에서 선택된 질병을 위한 제 25항에 따르는 조절배지, 제 26항에 따르는 조절배지의 사용 또는 제 27항 또는 29항에 따르는 사용개체의 상처 치료 보조(aid wound healing), 흉터 감소, 골 형성, 골 이식편 또는 골수 이식에 관한 제 23항 또는 제 28항의 조절 배지의 사용 (ⅰ) 하기의 하나 또는 그 이상으로부터 선택된 경로 조절: Rho GTPase에 의한 세포골격 조절, 세포 주기, 인테그린 신호 경로, 케모카인 & 사이토카인 신호 경로에 의해 매개된 염증, FGF 신호 경로, EGF 수용체 신호 경로, 혈관형성, 플라미스노겐 활성 케스케이드, 혈액 응고, 해당작용, 유비퀴틴 프로테아좀 경로, 신생 퓨린 생합성, TCA 회로, 페닐알라닌 생합성, 헴 생합성(ii) 하기의 하나 또는 그 이상을 포함하는 과정의 조절:세포 구조 및 운동성, 세포 구조, 세포 커뮤니케이션, 세포 운동성, 세포 유착, 엔도사이토시스, 마이토시스, 엑소사이토시스, 세포질분열, 세포 주기, 면역 및 방어, 사이토카인/케모카인 매개 면역, 대식세포-매개 면역, 과립백혈구-매개 면역, 리간드-매개 신호, 사이토카인 및 케모카인 매개 신호 경로, 신호전달, 세포외 기질 단백질-매개 신호, 성장인자 항상성, 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호 경로, 세포 유착-매개 신호, 세포 표면 수용체 매개 신호전달, JAK-STAT 케스케이드, 항산화 및 자유 라디칼 제거, 항상성, 스트레스성 반응, 혈액응고, 발달과정, 중배엽 발달, 골격 발달, 혈관형성, 근육발달, 근수축, 단백질 대사 및 변이, 단백질 분해, 단백질 접기, 단백질 복합 어셈블리, 아미노산 활성, 세포내 단백질 트래픽, 그 밖의 단백질 타겟팅 및 국소화, 아미노산 대사, 단백질 생합성, 단백질 황화물이성질화효소 반응, 탄수화물 대사, 해당작용, 오탄당-인산 션트(shunt), 그 밖의 다당류 대사, 퓨린 대사, 인산 대사의 조절, 비타민 대사, 아미노산 생합성, 전-mRNA 과정, 유전암호해독 조절, mRNA 스플라이싱(ⅲ) 하기의 하나 또는 그 이상을 포함하는 기능의 공급: 신호분자, 케모카인, 성장인자, 사이토카인, 인터루킨, 그 밖의 사이토카인, 세포외 기질, 세포외 기질 구조 단백질, 그 밖의 세포외 기질, 세포외 기질 당단백질, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 그 밖의 프로테아제, 프로테아제 저해제, 메탈로프로테아제 저해제, 세린 프로테아제 저해제, 산화환원효소, 탈수소효소, 과산화효소, 샤페론, 샤페로닌, Hsp 70과 샤페론, 그 밖의 샤페론, 합성효소, 신타아제 및 합성효소, 선택 칼슘 결합 단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 분해효소, 이성화효소, 그 밖의 이성화효소, ATP 신타아제, 수화효소, 아미노전이효소, 그 밖의 분해쇼소, 그 밖의 효소 조절자, 선택 조절 분자, 액틴 결합 세포결합 단백질, 세포결합 단백질, 비-운동 액틴 결합 단백질, 액틴 및 액틴 관련된 단백질, 아넥신, 튜불린, 세포 유착 분자, 액틴 결합 운동 단백질, 매개 필라멘트, 리보핵산단백질, 라이보솜 단백질, 유전암호해독 인자, 그 밖의 RNA- 결합 단백질, 히스톤, 칼모듈린 관련된 단백질, 소낭 코트 단백질(vesicle coat protein)을 위한 제 23항 또는 제 28항의 조절배지의 사용제 23항 또는 제 28항의 조절배지의 원재료와 함께 타겟으로 조절배지를 운송시키는 것이 가능한 디스펜서를 포함하는 조절배지 전달에 관한 전달체계 타겟으로 조절배지를 운송시키는 방법에 관한 제 34항의 전달체계의 사용참고문헌으로 상기에서 기술되며, 첨부된 도면의 도 1 내지 도 11에 나타난 바와 같은 조절화된 세포 배지를 제조하는 방법참고문헌으로 상기에서 기술되며, 첨부된 도면의 도 1 내지 도 11에 나타난 바와 같은 조절화된 세포 배지참고문헌으로 상기에서 기술되며, 첨부된 도면의 도 1 내지 도 11에 나타난 바와 같은 조절화된 세포 배지의 사용