초록

본 개시의 양태는 종래의 제조 방법에 비하여 몇몇의 개선을 제공함으로써 임상적으로 유용한 CAR T-세포 요법의 강건한 공급을 야기하게 할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

대표청구항 ▼

유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법이 하기를 포함하는 방법:(i) T 세포의 제1 집단을 제공하는 단계;(ii) 제1 Cas9 효소 및 CD70 유전자를 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 제1 리보핵단백질(RNP) 복합체를 상기 T 세포의 제1 집단 내로 도입하여, T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 T 세포의 제2 집단이 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계;(iii) 제2 Cas9 효소 및 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자를 표적화하는

유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법이 하기를 포함하는 방법:(i) T 세포의 제1 집단을 제공하는 단계;(ii) 제1 Cas9 효소 및 CD70 유전자를 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 제1 리보핵단백질(RNP) 복합체를 상기 T 세포의 제1 집단 내로 도입하여, T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 T 세포의 제2 집단이 파괴된 CD70 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계;(iii) 제2 Cas9 효소 및 T 세포 수용체 알파 사슬 불변 영역(TRAC) 유전자를 표적화하는 제2 gRNA를 포함하는 제2 RNP 복합체, 및 제3 Cas9 효소 및 베타-2 마이크로글로불린(β2M) 유전자를 표적화하는 제3 gRNA를 포함하는 제3 RNP 복합체를 상기 T 세포의 제2 집단 내로 도입하여, T 세포의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 T 세포의 제3 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계;(iv) 상기 T 세포의 제3 집단을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 함께 인큐베이션시켜, T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계로서, 상기 AAV 벡터가 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 TRAC 유전자에 대한 상동성 서열이 측접하며, 상기 T 세포의 제4 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계;(v) 상기 T 세포의 제4 집단을 증량(expanding)시킴으로써, 증량된 T 세포 집단을 생성하는 단계;(vi) 상기 증량된 T 세포 집단으로부터 TCRαβ+ T 세포를 제거하여, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 생성하는 단계로서, 상기 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단이 파괴된 CD70 유전자, 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는 단계; 및(vii) 상기 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 수거하는 단계.