[특허]Method and kit for expressing protein under regulation of the expression from repeated sequence formed by gene amplification, and transformant

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IPC분류정보
국가/구분	United States(US) Patent 등록
국제특허분류(IPC7판)	C12N-015/85 C12N-015/87 C12N-015/90 C12N-015/113 C12N-005/16
출원번호	US-0889512 (2007-08-14)
등록번호	US-8771983 (2014-07-08)
우선권정보	JP-2004-334984 (2004-11-18); JP-2005-121431 (2005-04-19)
발명자 / 주소	Shimizu, Noriaki
출원인 / 주소	National University of Corporation Hiroshima University
대리인 / 주소	Harness, Dickey & Pierce, P.L.C.
인용정보	피인용 횟수 : 0 인용 특허 : 25

초록 ▼

A method is disclosed for releasing the transcriptional regulation caused by a repeated sequence in a gene, a kit therefor and so on to thereby establish a system capable of producing a protein in a large amount. At least one embodiment of the method can be achieved by any one or more of the following methods: (a) in the amplification of a gene encoding a target protein, co-amplifying a polynucleotide of 10 kbp or more such as a λ-phage DNA or an insulator sequence; (b) selecting by culturing cells having undergone gene amplification in media containing a drug with a gradual increase in concentration; (c) elevating the promoter activity of inducing the expression of a gene encoding a target protein; (d) excising an amplified gene region from a chromosome with the use of Cre-LoxP System; (e) treating cells having undergone gene amplification with 5-aza-2′-deoxycytidine to thereby lower the methylation degree of DNA; and (f) selecting the mammalian cells having undergone gene amplification on double minute chromosomes.

대표청구항 ▼

1. A method of expressing a protein from a repeated sequence formed in CHO cells in which gene amplification is induced, the protein having been under expression repression, the method comprising (1) transfecting into the CHO cells (a) a gene structure comprising (i) a first polynucleotide having an origin of replication and a nuclear matrix attachment region that functions in eukaryotic cells and a selection marker that is a drug resistance gene which confers resistance to an antibiotic, and(ii) a second polynucleotide having a promoter region controllably linked to a polynucleotide encoding a protein to be expressed and an insulator sequence; and(b) a polynucleotide encoding a transcription activation factor of the promoter; and(2) subsequently treating the transfected CHO cells with 5-aza-2′-deoxycytidine at a concentration in the range of 1-2 μM and culturing the transfected CHO cells sequentially in a medium of increasing concentrations of the antibiotic whereby the concentration of the antibiotic increases by 10% to 30% per 24 hours. 2. The method as set forth in claim 1, further comprising selecting CHO cells in which the gene amplification occurs on a double minute chromosome. 3. The method as set forth in claim 1, wherein the origin of replication is an origin of replication of a c-myc locus, a dihydrofolate reductase locus, or a β-globin locus. 4. The method as set forth in claim 1, wherein the nuclear matrix attachment region is a nuclear matrix attachment region of an IgK locus, a SV40 initiation region, or a dihydrofolate reductase locus. 5. The method as set forth in claim 1, wherein the transfection is simultaneous. 6. A transformed CHO cell selected by (1) transfecting into the CHO cell, (a) a gene structure comprising a first polynucleotide having an origin of replication and a nuclear matrix attachment region that functions in eukaryotic cells and a selection marker that is a drug resistance gene which confers resistance to an antibiotic, and(ii) a second polynucleotide having a promoter region controllably linked to a polynucleotide encoding a protein to be expressed and an insulator sequence; and(b) a polynucleotide encoding a transcription activation factor of the promoter; and(2) subsequently treating the transfected CHO cell with 5-aza-2′-deoxycytidine at a concentration in the range of 1-2 μM and culturing the transfected CHO cell sequentially in a medium of increasing concentrations of the antibiotic whereby the concentration of the antibiotic increases by 10% to 30% per 24 hours. 7. The transformant as set forth in claim 6, wherein the origin of replication is an origin of replication of a c-myc locus, a dihydrofolate reductase locus, or a β-globin locus. 8. The transformant as set forth in claim 6, wherein the nuclear matrix attachment region is a nuclear matrix attachment region of an IgK locus, a SV40 initiation region, or a dihydrofolate reductase locus. 9. The transformant as set forth in claim 6, wherein the transfection is simultaneous.

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