초록 ▼

진핵생물(고등생물)과 원핵생물(미생물)은 서로 많은 차이점을 가지고 있다. 그중에서 유전자의 구조와 유전자의 발현과정이 제일 두드러지게 차이가 있다. 본 연구에서는 유전자 발현에 촛점을 맞추되 고등생물 유전자가 미생물 세포에서 발현되도록 하려는 것이다. 연구의 촛점은 미생물의 RNA polymerase binding site와 Ribosome binding site가 있는 부위 뒤에 제한효소 작용부위를 만들어 놓는 일이다. 이를 달성하기 위해서는 두가지 방법을 채택하였다. 첫째 방법은 E. coli system을 사용하여 pER

진핵생물(고등생물)과 원핵생물(미생물)은 서로 많은 차이점을 가지고 있다. 그중에서 유전자의 구조와 유전자의 발현과정이 제일 두드러지게 차이가 있다. 본 연구에서는 유전자 발현에 촛점을 맞추되 고등생물 유전자가 미생물 세포에서 발현되도록 하려는 것이다. 연구의 촛점은 미생물의 RNA polymerase binding site와 Ribosome binding site가 있는 부위 뒤에 제한효소 작용부위를 만들어 놓는 일이다. 이를 달성하기 위해서는 두가지 방법을 채택하였다. 첫째 방법은 E. coli system을 사용하여 pER 322에 λphage의 pL promoter를 제조합해 넣는 것이다. 두번째의 접근 방법은 ribbit homoglobin mRNA에서 CDNA를 합성하고 이의 완전성과 발현성을 살펴보는 것이다. (동물학회지 27권 103-116, 1984). 본 실험에서 얻은 결론은 prokaryotic promoter 중에서 가장 강력하다고 알려진 λ phage의 pL promoter를 갖는 273 bp의 DNA 조각을 Hpa II로 처리해서 얻어 pER 322의 Cla I site에 삽입하였다. 이의 시계반대 방향으로 들어간 것을 pPL 83 이라 명명하고, 들어간 pL promoter의 효율은 β-lactamase 생산 및 활성도를 측정함으로서 확인되었다. 이 결과는 한국생화학회지 (17권 177-187, 1984)에 게제되었다. Rabbit hemoglobin mRNA로 cDNA를 합성하는데는 Ologo(dT) 존재하에서 AMV reverse transcroptase로 promary cDNA를 합성하고, 알칼리 처리, Klenow enzyme과 reverse transcroptase를 차례로 작용시켜 double standed DNA를 합성하고, hairpin loop을 Sl nuclease로 제거한 다음 terminal deoxynucleotidyl transferase로 cDNA에 poly(dC) track을 만들었다. pBR322의 Pst I 자리에는 poly(dG) track을 만든 다음 합성한 cDNA와 재조합시켰다. 이는 Ap gene의 promoter 관할하에 있게되며 이론적으로 fused protein이 나오게 되어 있는데 double antibody를 사용한 radio immunoassay 법으로 조사한 결과 rabbit hemoglobin이 대장균 속에서 대량생산되었음을 알 수 있었다. 이 결과는 동물학회지 (27권 103-116, 1984)에 발표되었다.

Abstract ▼

In recombinant DNA technology, the gene has been generally inserted into a multicopy vector system such that the gene is transcribed from a strong promoter. The level of expression of the protein product may be due to the strength of the promoter, or to the composition and length of the untranslated

In recombinant DNA technology, the gene has been generally inserted into a multicopy vector system such that the gene is transcribed from a strong promoter. The level of expression of the protein product may be due to the strength of the promoter, or to the composition and length of the untranslated leader sequence. The effective system for producing foreign proteins should have strong promoter and its regulatability. One of well-known strong and regulatable promoters is the pL promoter of bacteriophage lamda. The activity of the pL promoter can be controlled by using the host strain that synthesize a thermolable repressor from a CI 857 gene present on the host chromosome. In order to reach this goal, we isolated 273 bp DNA fragment contain pL promoter with Hpa II, and inserted Cla I site of pBR 322. We named the recombinated plasmid pPL 83(anti-clockwise polarity) and pPL 84 (clockwise polarity). For the test of gene expression behind of pL promoter, the β-lactamase genes of the plasmid was induced by temperature and measured its activity. This results was published in Korean biochemical Journal(vol.17, pp.177-187, 1984). In order to express eukaryotic gene sequences in bacteria, two basic approaches are available. In one case, the cloned eukaryotic coding sequences are spliced into the bacterial gene such that the bacterial initiation codon is followed directly by the codon for the first amino acid of eukaryotic protein. In the other, the coding sequence is inserted into an initial position in gene so that the sequences are in phase with the bacterial coding sequences, which results in the synthesis of a hybrid bacterial-eukaryotic protein, from which eukaryotic protein has to be released. We chose the latter approaceh. The structural gene of rabbit hemoglobin was cloned into Pst I site of pBR 322 in E. coli. The complemenrary DNA (cDNA) was synthesized from rabbit globin mRNA with an sequential reaction of avian myeloblastosis viral reverse transcriptase, alkali treatment, Klenow enzyme/DMV reverse transcriptase, and Sl nuclease treatment. Double stranded cDNA was subsquently tailed with dCTP and annealed to dGMP-tailed vector DNA. The expression of cloned globin gene was investlgated by standard radioimmunoassay using rat anti-rabbit Hb serum as primary antibody and goat antirat IgG serum as secondary antibody. The result suggested that the chimeric proteins were supposedly produced in E. coli and the product had the antigenic determinant of rabbit hemoglobin. This result was published in Korean Journal of Zoology (vol.27, pp.103-116, 1984).

목차 Contents

• 표지...1
• 1. 연구내용...7
• 2. 연구내용...8
• 3. 주요 내용 및 결과...11
• 5. 기대효과 및 활용방안...20
• 6. 인용문헌...25
• 7. 논문발표실적...25