초록 ▼

Brevibacterium divaricatum 균주로부터 BdiI 제한효소를 부분 정제하였다. BdiI의 인지부위는 5'ATCGAT3' 이였고 CalI과 isoschizmer 였다. 자르는 부위는 T 와 C사이에서 (5'AT/CGAT3') 5pCG를 Cohesive end로 만듬을 알았다. 이 효소의 최적 활성온도는 37℃였고 50-100mM의 NaCl농도에서 활성이 높았고 150mM에서는 활성이 저해되었다.
BdiI methylase 유전자를 재조합하기 위하여 pBR322의 EcoRI 및 SalI의 인지부위를 사용하였다.

Brevibacterium divaricatum 균주로부터 BdiI 제한효소를 부분 정제하였다. BdiI의 인지부위는 5'ATCGAT3' 이였고 CalI과 isoschizmer 였다. 자르는 부위는 T 와 C사이에서 (5'AT/CGAT3') 5pCG를 Cohesive end로 만듬을 알았다. 이 효소의 최적 활성온도는 37℃였고 50-100mM의 NaCl농도에서 활성이 높았고 150mM에서는 활성이 저해되었다.
BdiI methylase 유전자를 재조합하기 위하여 pBR322의 EcoRI 및 SalI의 인지부위를 사용하였다. 5.6 kb의 EcoRI 의 EcoRI insert DNA 를 가지는 pBDIM116이 BdiI methylase 유전자를 갖는 것으로 판명되었다. 이 프라스미드를 갖는 숙주는 S-adenosylmethionine 의존하는 BdiI 인지부위에만 특정한 methylase 활성이 측정되었다. Methylase 의 특징은 pH 7.5와 NaCl 0-50mM에서 활성도가 가장 높았다.

Abstract ▼

A new type II restriction endonuclease, BdiI, has been isolated from Brevibacterium divaricatum. The purified BdiI restriction endonuclease had the same cleavage patterns of ClaI whose recognition sequence is 5'ATCGAT3'. The BdiI cuts between T and C (5'AT/CGAT3') and produces 5'pCG cohesive end. Th

A new type II restriction endonuclease, BdiI, has been isolated from Brevibacterium divaricatum. The purified BdiI restriction endonuclease had the same cleavage patterns of ClaI whose recognition sequence is 5'ATCGAT3'. The BdiI cuts between T and C (5'AT/CGAT3') and produces 5'pCG cohesive end. The optimal temperature for BdiI was 37 C and optimal salt (NaCl) concentration was 50 - 100 mM.
The gene for the BdiI modification enzyme from Brevibacterium divaricatum was cloned and expressed in E. coli. For cloning the methylase gene three cloning site (EcoRI, BamHI and SalI) of pBR322 were adopted. The recombinant plasmid pBDIM116 containing 5.6 kb EcoRI insert was proved to carry the gene. Crude cell extract prepared from strains carrying the plasmid contained an S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase activity specific for the BdiI recognition site, ATCGAT.

목차 Contents

• 1. 연구제목...8
• 2. 연구목적, 내용 및 방법...8
• 2.1. 연구목적 및 내용...8
• 2.2. 연구방법...9
• 2.2.1. 시약...9
• 2.2.2. 균주 및 배지...9
• 2.2.3. DNA와 효소...10
• 2.2.4. BdiI 제한효소와 methylase분리...10
• 2.2.5. BdiI 제한효소의 활성 측정...10
• 2.2.6. BdiI 제한효소의 인지부위(recognition site) 결정...11
• 2.2.7. BdiI methylase의 활성 측정...11
• 2.2.8. BdiI methylase 유전자의 cloning...11
• 2.2.9. BdiI methylase 유전자의 제한효소 지도 작성...12
• 3. 연구계획 대진도...13
• 4. 주요연구 내용 및 결과...14
• 4.1. BdiI 제한효소(Restriction endonuclease)의 분리 및 특성 연구...14
• 4.1.1. BdiI 제한효소의 분리...14
• 4.1.1.1. Ammonium sulfate fractionation...14
• 4.1.1.2. DEAE-cellulose(DE-52) chromatography...14
• 4.1.1.3. Heparin-agarose chromatography...15
• 4.1.2. BdiI 제한효소의 특성 연구...16
• 4.1.2.1. BdiI 인지부위(recognition site) 결정...16
• 4.1.2.2. BdiI의 cleavage mode 검정...16
• 4.1.2.3. BdiI 제한효소의 catalytic properties...17
• 4.2. BdiI methylase 유전자의 대장균 내의 cloning과 발현...18
• 4.2.1. BidI methylase 유전자의 cloning...18
• 4.2.2. BidI methylase 유전자의 대장균 내에성의 발현...19
• 4.2.3. BidI methylase 유전자의 제한효소 지도...19
• 4.3. BdiI methylase의 분리 및 특성...21
• 4.3.1. BidI methylase의 분리...21
• 4.3.1.1. Ammonium sulfate fractionation...21
• 4.3.1.2. DEAE-cellulose(DE-52) chromatography...21
• 4.3.1.3. Phosphocellulose(P-11) chromatography...21
• 4.3.2. BdiI methylase의 specificity...22
• 4.3.3. BdiI methylase의 효소적 특성...22
• 5. 참고문헌...24
• 6. 그림설명...25
• 7. 애로 및 건의사항...53