초록 ▼

대장균의 지방단백질은 세포 막간 공간에 존재하는 것으로 세포내에 존재하는 분자 개수로 볼때 가장 많이 존재하는 단백질들 가운데 하나이며 이는 지방 단백질 유전자 DNA의 전사를 제어하는 promoter가 아주 강력하다는 것을 의미한다. 프라스미드, p1N-111 B3, 는 지방단백질 프로모터, 젖당 프로모터 및 오퍼에이터를 갖고 있으며 흔히 이중 프로모터 (double promoters)를 갖고 있다고 칭한다.
이 재조합 프라스미드는 또한 lac I 유전자를 갖고 있어서 여기서 생산되는 lac repressor 는 같은 프라

대장균의 지방단백질은 세포 막간 공간에 존재하는 것으로 세포내에 존재하는 분자 개수로 볼때 가장 많이 존재하는 단백질들 가운데 하나이며 이는 지방 단백질 유전자 DNA의 전사를 제어하는 promoter가 아주 강력하다는 것을 의미한다. 프라스미드, p1N-111 B3, 는 지방단백질 프로모터, 젖당 프로모터 및 오퍼에이터를 갖고 있으며 흔히 이중 프로모터 (double promoters)를 갖고 있다고 칭한다.
이 재조합 프라스미드는 또한 lac I 유전자를 갖고 있어서 여기서 생산되는 lac repressor 는 같은 프라스미드 상에 클론되어 있는 다른 외부 유전자의 구조단백질이 지나치게 많이 생산되는 것을 방해하여 숙주세포에 나쁜 영향이 생기지 않게 한다.
IPTG는 젖당의 유사체이긴하나 대사될 수 없는 분자 구조를 갖고 있어서 lac repressor 가 결합하지 못하게 하여 유전자 발현을 가능하게 하는 유도체로서 사용된다. 알파 인터페론 유전자를 pBR322의 PstI site 에 갖고 있는 Hif-2h프라스미드로부터 알파인터페론 유전자를 끄집어내어 p1N-111 B3 프라스미드의 Hind III와 BanHI site 들의 사이에 전달 끼워 넣었다. 이때 만들어진 재조합 프라스미드를 p1F-111-B 라 명명하였다. p1F-111-B 프라스미드로부터 생산되는 알파 인터페론의 생산량은 숙주 세포에 따라 달랐으나 대체적으로 Hif-2h 프라스미드로부터 생산되는 것 보다 최소한 130배 이상이었다. Double Promoters 유전자를 연결하여 그 다음에 들어간 알파 인터페론 유전자와 적절한 signal peptide를 갖게 함에 의하여 생산되는 fused protein 의 50% 정도가 세포밖으로 excretion 또는 secretion 되게 할 수 있었다. Hif-2f 의 경우 알파 인터페론의 세포 체외 생산은 없었다.
LB 배지 내에서의 알파 인터페론 생산을 위한 최적 배양조건을 조사하엿다. 최적조건으로 pH 7.0, 1PTG 농도 0.3mM - 1.0mM, NaCl농도 2% W/V, 그리고 초기 발현 유도 보다는 대수기 발효 유도 등이다. 발현 유도물질에 의한 발현 생산이 세포 증식에 미치는 영향을 수식 모델화하는 작업을 수행하였으며 프라스미드 안정성에 대한 고려도 하였다. 콤퓨터 자동제어를 위한 인터페이싱이나 실제 콤퓨터제어도 수행되었으나 본 보고서에서는 극히 일부 결과에 대하여만 잠깐 언급하기로 한다.

Abstract ▼

Lipoprotein of E. coli is thought to be one of the most abundant proteins in terms of numbers of molecules in the periplasm of E. coli implying that its promoter is very strong. The plasmid, pIN-lII B3, has a lipoprotein promoter, lactose promoter and operator, often said to have double promoters. T

Lipoprotein of E. coli is thought to be one of the most abundant proteins in terms of numbers of molecules in the periplasm of E. coli implying that its promoter is very strong. The plasmid, pIN-lII B3, has a lipoprotein promoter, lactose promoter and operator, often said to have double promoters. The plasmid also has lacI gene from which lac repressors are produced to prevent the plasmid from overproducing foreign proteins which are very harmful to host strain harboring the plasmid into which foreign gene is cloned.
IPTG, unmetabolizable analogue of lactose, is used to prevent lac repressor from combining with lac operator. In other words IPTG is used as an inducer.
Alpha-interferon gene was transferred from the plasmid, Hif-2h, which has alpha-interferon gene at PstI site of pBR322 to the region between HindIII and BamHI sites of pIN-III B3. The reconstructed plas- mid was named pIF-III-B. The production level of alpha-interferon from pTF-III-B was observed to be ca. 130 times as high as that from Hif-2h With the aid of signal peptide of lipoprotein, about 50X of total interferons produced were excreted or secreted. In case of Hif-2h, there was no extracellular activity of alpha-interferon.
Optimum cultivation conditions for the alpha-interferon production in LB medium were investigated. Optimum conditions appeared to be pH7.0, 0.5mM-1.0mM of IPTG concentration, 2% of NaCl in w/v, and in- duction at log phase rather than initial induction.

목차 Contents

• 1. Introduction...13
• 1.1. General over view...13
• 1.2. Classification of of human interferon...15
• 1.3. Cellular production of interferon...18
• 1.4. Large scale production of human alpha-IFN employing recombinant microorganism...19
• 1.4.1. Introduction...19
• 1.4.2. Fermentation...20
• 1.4.3. Recovery...22
• 1.4.4. Purity and identity...23
• 1.5. Plasmid stability in E.coli...25
• 1.5.1. Review of papers about plasmid stability...25
• 1.5.2. Some proposals to ensure the stability...29
• 1.6. Host-vector system for protein secretion...31
• 2. Materials and Methods...33
• 2.1. Gene manipulation...33
• 2.1.1. Strains and plasmids...33
• 2.1.2. Plasmid DNA isolation from E.coli strain...33
• 2.1.2.1. Culture of E.coli strain...36
• 2.1.2.2. Reagents for plasmid isolation...36
• 2.1.3. Restrictiondigestion and ligation...38
• 2.1.4. Agarose gel electrophoresis...39
• 2.1.5. Transformation of E.coli...39
• 2.1.6. Induction with IPTG...41
• 2.2. Expression and preparation of samples...41
• 2.2.1. Induction of alpha-IFN expression...41
• 2.2.2. Preparation of crude E.coli extract...41
• 2.2.3. Preparation of samples from culture broth...42
• 2.2.4. Preparation of samples from the periplasm of E.coli...42
• 2.3. Assay of samples...43
• 2.3.1. Cell line and virus...43
• 2.3.2. Cryopreservation of Hep2 cell...43
• 2.3.3. Thawing of Hep2 cell out...44
• 2.3.4. Assay of sample from E.coli...44
• 2.4. Fermentor operation...45
• 2.5. Plasmid stability of recombinant E.coli cells...45
• 2.6. Preparation of other reagents...47
• 2.6.1. Antibiotics...47
• 2.6.2. IPTG...47
• 2.6.3. X-gal...47
• 2.6.4. Siliconization...48
• 2.6.5. Phenol and chloroform for extraction of nucleic acids...48
• 2.6.6. Lysozyme...48
• 2.6.7. Determination of dry cell mass...48
• 2.6.8. Preparation of standard alpha-IFN solution...49
• 3. Results and discussion...51
• 3.1. Construction of expression vector...51
• 3.1.1. Analyses of alpha-IFN sequence and Hif-2h...51
• 3.1.2. pUC vextor system...51
• 3.1.3. pIN vector system and lpp signal sequence...58
• 3.1.3.1. Lpp of outermembrane...58
• 3.1.3.2. pIN vectors...62
• 3.1.3.3. Construction of pIF-III-B...66
• 3.2. Determination of optimal dilution ratio of VSV concentrate for the assay of alpha-IFN activity...70
• 3.3. Production of alpha-IFN in various E.coli strains harboring various recombinant plasmid vector...70
• 3.4. Effect of recombinant plasmid and inducer on the host cell growth...79
• 3.5. Stability of recombinant plasmid pIF-III-B...85
• 3.5.1. Some considerations on the recombinant plasmid stability...85
• 3.5.2. Stability of recombinant plasmid pIF-III-B...87
• 3.6. Production of alpha-IFN under various enviornmental conditions...91
• 3.6.1. Effect of amp concentration...91
• 3.6.2. Effect of IPTG concentration...94
• 3.6.3. Effect of pH...95
• 3.6.4. Effect of salt concentration...98
• 3.7. Production of alpha-IFN by fermentor operation...99
• 3.7.1. pH variation and production of alpha-IFN along the culture time course...99
• 3.7.2. Effect of induction time on the alpha-IFN production...102
• 3.8. Analysis of inducer concentration effects on the specific growth rate of recombinant E.coli...108
• 3.8.1. Product inhibition in fermentation...108
• 3.8.2. Product formation kinetics based on molecular mechanism (Genetically structured model)...108
• 3.8.3. Comparison of model equation with experimental data...114
• 3.9. Some considerations about improving the production of recombinant DNA proteins...117
• 4. Conclusion...119
• Nomenclatures and Symbols...121
• Abbreviations...123
• References...125
• APPENDIX...132
• Computer에 의한 온도 제어 알고리듬 및 그 결과...132