초록 ▼

본 연구에서는 생물공정의 안정성과 제품의 수율 및 생산성을 제고시켜 기존의 생물공정 및 화학공정보다 우수한 고수율, 고생산성의 생물공정을 개발함이 가장 중요한 목적이며 아울러 이를 통하여 국내의 바이오 리엑터 기술의 수준 향상과 유전공학/생물 공학제품의 상품화 기술을 조기 정착시켜 국내 기반 기술의 축적을 꾀하고자 한다.
본 연구는 각각 다섯 부분으로 나누어 이중실관 생물 반응기를 이용한 구연산 및 과당의 연속생산에 관한 부분과 Membrace cell recycle reactor system을 사용한 고농도 세

본 연구에서는 생물공정의 안정성과 제품의 수율 및 생산성을 제고시켜 기존의 생물공정 및 화학공정보다 우수한 고수율, 고생산성의 생물공정을 개발함이 가장 중요한 목적이며 아울러 이를 통하여 국내의 바이오 리엑터 기술의 수준 향상과 유전공학/생물 공학제품의 상품화 기술을 조기 정착시켜 국내 기반 기술의 축적을 꾀하고자 한다.
본 연구는 각각 다섯 부분으로 나누어 이중실관 생물 반응기를 이용한 구연산 및 과당의 연속생산에 관한 부분과 Membrace cell recycle reactor system을 사용한 고농도 세포배양및 알콜 생산, 항생제의 연속발효생산을 위한 유동층 생물반응기의 개발, 바이오리액터내에서의 재조합세포의 안정성에 관한 연구, 마지막으로 유기용매상에서의 효소반응과 이를 위한 생물반응기의 설계로 나누어 수행되었다.
이중실관 생물반응기의 실험에서는 내경 0.8cm, 길이 30cm의 유리관과 그 내부에 이중실관 유니트를 평행하게 삽입하였다.
회분식 발효를 통한 최적생산조건을 알아보았으며 nitrogen-enrichrd medium을 사용한 구연산 연속 생산 실험을 수행하였다. 이 경우에 세포성장의 결과로 실리콘튜브의 팽창이 일어났기 때문에 이것을 개선하기 위하여 초기에는 nitrongen source를 포함하는 growth medium으로 세포를 배양하고 production stage에서는 nitrongen-deficient medium을 공급해 줌으로써 성장이 정지된 reating cell에 의한 구연산 생산실험을 수행하였다. nitrgen-enriched medium을 이용했을때 구연산의 농도는 3.8g/L을 나타내었으며 일반적으로 고정화된 세포를 사용할 경우 회분식의 경우보다 2배 내지 3배 가량의 높은 생산성을 보여준다. 그런데 이중실관 생물반응기를 이용한 구연산의 생산은 다른 경우보다 수율과 생산성면에서 더 우수함을 나타냈다.
이중실관 생물반응기를 whole cell enzyme의 고정화에 응용 하였고 이를 위해서 glucose isomerase에 의한 과당 생산 기초 실험과 glucose isomerase characteration을 수행하였다. 이중실관 생물반응기에서의 연속생산 실험에서 과당의 농도는 실리콘 튜브의 부피 기준과 유리관의 부피 기준으로 볼때 각각 22.5g.L.h, 7.6g/L.h의 생산성을 보였고 이것은 회분식의 경우보다 각각 12배, 4,2배이다.
반응기의 길이에 따른 영향을 살펴본 결과 기질의 소비율은 18%에서 24%로 증가하였으나 구연산율은 42%에서 37%로 낮아졌다.
이것은 배지가 축 방향으로 흘러 가면서 반응기에 의하여 기질이 감소하고 이에 따라 기질소모속도가 저하되면서 균체자체의 maintenance energy가 차지하는 비율이 증가 하는 이유때문이다. 반응기 반경에 따른 영향을 살펴본 결과 반경이 늘어남에 따라 배지공급유속이 증가하게 된다. 유속의 증가에 따라 sucrose의 소비속도가 증가하고 구연산 생산성이 증가한다. 이는 배지의 공급유속이 증가하면서 반경방향의 기질종도 기울기가 커지고 실관내 압력강하가 커지는 등의 이유로 보다 고농도의 기질이 균체층에 전달되기 때문이다.
이중실관 반응기의 구조를 살펴보면 몸체는 내경 0.8cm 길이 30cm 유리관이공 그 내부에 이중실관 유니트를 평행하게 삽입하였다. 각유니트는 세가닥의 microprous polypropylene hollow fiber를 넣은 한개의 실리콘 튜브로 이루어지고 미생물은 실리콘 튜브와 pp hollowfiber 사이에서 자라도록 하고 실리콘 튜브쪽으로 공기를 공급하고 pp hollow fiber로는 nutrient를 공급한다.
한외 여과막 재순환 장치를 이용한 생물반응기의 개발연구에서는 그 일환으로 Kluyveromyces fragilis를 사용하여 이눌린으로부터 알콜을 생산하는 공정에 대하여 연구를 수행하였다. 이눌린의 연구가 낮을 시에는 (2.5%) 희석율 0.20h 이하에이기 위하여 이눌린의 농도를 높이기 위하여 이눌린의 농도를 높일 경우 (5.0%) 희석율 0.1h??에서도 이눌린분해단계가 알콜발효의 제한단계로 작용하였다. 따라서 재순환 반응기의 이눌린 분해능력을 더 높일 수 있는 방안으로 K.fragilis의 inulase를 세포내에 고정화시켜 재순환 반응기에 첨가해 주는 방법으로 반응기내 효소의 활성도를 높일 수 있었다. 또한 이눌린의 당화-발효공정의 해석을 위하여 동시당화 및 발효공정의 모델링을 시도하였다.
항생제의 연속발효 생산을 위한 유동층 생물반응기의 개발연구에서는 흡착정도가 가장 좋은 celite를 담체로 선정하여 Penicillium dhrywogenum 또는 Streptomyces erythreus의 포자를 흡착시켜 배양하면 균사증식 담체가 잘 형성되었다. 항생제의 연속생산을 위해 균사 증식 담체를 반응기내에 retention시키면서 공정을 연속적으로 수행할 수 있는 in-situcell separation 유동층 생물 반응기를 개발하였다. 유동층 생물반응기의 성능을 알아보기 위해서 산소전달능력을 측정한 결과, superficial air velocity를 1.5에서 15cm/sec로 변화시켰을 때 배지의 산소전달속도상수, k,a는 450에서 700hr??까지 변하였다. 또한, 생물반응기의 유동특성을 알아보기 위해 mixing time 과 circulation time을 측정하였을때 draft tube의 높이에 따라 큰 차이는 없었으나, draft tube의 존재는 유체의 흐름을 규칙적이고 안정되게 하는 것임을 알 수 있었다. 인산염 제한을 통하여 penicillin 발효뿐만 아니라 erythromycine 발효에서도 미생물의 비생산성을 약 3∼4배 증가시킬수 있었고 생물반응기의 연속조업에 의하여 균사 증식 담체의 활성을 오랫동안 유지시킬수 있었다. 또한, 이때 배지 중의 인산염의 공급속도를 조절함으로써 penicillin 및 erythromycine생산 세포의 활성을 약 20-30일간을 유지시킬 수 있었다. 그리고 연속조업중 세포의 활성이 떨어지게 될 경우 약 30일간 안정적으로 반응기를 조업할 수 있었다. 그러나 erythromycin의 경우 활성화는 되지만 다시 활성이 감소되는 경향이 뚜렷하였다. 그러므로 세포의 활성을 연속적으로 monitoring하면서 인산엽의 공급을 feed-back control할 수 있는 공정의 개발 분야를 앞으로 더 연구해야 할 것이다.
바이오리액터내에서의 재조합세포의 안정성에 관한 연구에서는 발효조내의 물리적, 생물화학적 변수를 측정할 수 있는 믿을 만한 기구의 부족과 의미있는 발효공정제어를 위한 적당한 수학모델의 부족이 성공적인 on-line induction에 관한 일은 거의 찾아볼 수 없었다.
본 연구에서는 새로운 software와 interface를 개발함으로써 콤퓨터에 의한 유전자 재조합 세포 발효공정의 on-line optimal induction을 성공적으로 수행할 수 있었다. 개발된 software는 용존산소를 정확하게 제어할 수 있었고 자체 제작한 interface에 의하여 on-line optimal induction을 수행할 수 있었다. 그 외에도 외부 analog controller의 도움으로 수소이온 농도나 온도, 그리고 RQ같은 몇몇 변수들을 제어할 수 있었으며 peristatic pump를 작동시키는 제어신호를 낼 수 있기 때문에 fed-batch발효의 온라인 제어도 자유자재로 수행할 수 있게 되었다. 산소 및 탄산가스등 가스분석기의 데이타를 콤퓨터에 입력하여 자동제어에 사용할 수 있게 되었기 때문에 RQ등 피제어변수의 영역을 더욱 넓힐 수 있게 되어 mass spectrometer등 hardware의 단순치환에 의하여 더욱 정확하고 광범위한 발효공정콤퓨터 on-line자동제어를 수행할 수 있게 되었다.
유기용매를 고용하여 지방산과 특정 지질 생성에 효소를 이용하는 것이 매우 활발히 연구되고 있으며 많은 반응계가 시도되고 있다. 이때 효소의 안정성 유지를 위해 효소의 변성기작을 이해할 필요성 때문에 먼저 Candida ruggosa리파제의 변성 기작을 연구하? 구성된 복합적 과정이었다. 1) 일차타내는 전이단계, 3) 일차적 반응에 근접하여 변하는 마지막 단계로 구성되었다. 이러한 결과를 기초지식으로 하여 "Reversed micellar system"과 "Reversed phase system"내에서 트리글리세리드를 가수분해하였으며 이에 대한 kietic analysis를 성공적으로 수행하였다. 한편, 반응성 영역을 확대하고자 Chromobacter ium viscosum 리파제를 "Reversed system"내에서 회분식 및 연속식 glycolysis 반응을 행하였으며 콤퓨터를 이용한 kinetic analysis 를 성공적으로 수행하였다.

Abstract ▼

The main purpose. of this project is to deve.lop the excellent bioprocess exhibiting higher yield and productivity than existing bioprocess or chemical process.
It is hoped that this project lead to the great progress of domestic bioreactor technique and offer a basis for the commercialization o

The main purpose. of this project is to deve.lop the excellent bioprocess exhibiting higher yield and productivity than existing bioprocess or chemical process.
It is hoped that this project lead to the great progress of domestic bioreactor technique and offer a basis for the commercialization of genetic engineering and bioengineering techniclue to be moved up. As a result, the accurnulation of basic technology will be achieved and the international competitiveness will be increased. DEFBR(Dual llollow Fiber Bio-Reactor) consist of a glass tube which includes parallel dual hollow fiber units. The dual hollow fiber unit is silicon tube which has three microporous polypropylene hollow fiberg. Air and nutrient are supplied through silicon tube inside Emd polypropylene hollow fibers respectively.
A study was carried about how we can improve the produlctivity using DHFBR. The citric acid procblction in DHFBR appears to be better than other studies in terms of yield and productivity despite of its lower titre in the shake flask culture.
Furthermore, it is notable that the continuous system in DHFBR yielded 20 fold volumetric productivity of the batch system.
The immobilization of whole cell enzyme using the DHFBR provided the simple immobili zation procedure by irnmobilizing the whole cell enzyme simultaneously with cell proliferation and high productivity by loading the whole cells of high density in the renctor. As the culture period increased, the cell mass in the reactor increased and thus the reactor productivity increased. However, as the culture period became longer, glucose isomerase in the reactor was rapidly deactivated by protein degrading enzymes such as proteinase. Thus the method to inhibiting the protein degrading enzymes during cell growth was required for the purpose of obtaining the higher productivity.
As the number of reactorunit was increased, the productivity was improved continuously due to higher consumption rate of substrate.
To develop the ultrafiltration membrane bioreactor, the production of ethanol from inulin using Kluyveromyes fragiliswas attempt as a model process.
The degree of saccharification of inulin to fractose and glucose was not limiting factor when the system was operated in low dilutlon rate and inulin conc.entration less than 0.2h??and 2.5%, respectively. However, when the concentration of inulin was increased to obtain high ethanol productivity, the sacchrification was rate limitingstep. To increase the inulase activity in fermerlter, K.fragils cells harbouring the inulase was added into fermenter after fixation of e.nzyme in cells.
The modelling of the simutaneous saccharification and ethanol fermentation process was also attempt.
A carrier-supported mycelial growth of Streptomyces erythreus was applied to penicilliin or erythtromycin fermentation system using celite as the best support material . Hyphal growth through the. pore matrices of the materials showed anchorages and provided a stable biofilm growth. In-situ cell separation fludized-bed bioreactor was designed and tested for continuous antibiotic production using the bioparticles.
Oxygen transfer rate coefficients were eq-timated to test the perfor-mance of the fludized-bed bioreactor. When the valueg of the superf'ical air velocity were changed from 1.5 to 15cm/sec, the values of the oxygen tramsfer coefficient in the medium were shown from 450-700 hr 1. In order to examine the flow characteristi.cs of the bioreac.tor, mixing and circulation time were measured and their values were shown constant regardless of the height of draft tube within the bioreactor and it could be known that draft tube made the flow pattern constant and stable. When phosphate concentration was limited, the maximum specific production rate of penicillin or erythromycin was increased more than three times and the antibioticproducing activity of the bioparticle could be maintained for about 20-30 days by controlling the phosphate feeding rate. Erythromycin producing activity of the bioparticles could bo regenerated by extra addition of phosphate, however, the activity was decreased again during the operation. Thefore, the development of the sensor and method to monitor conti.nuously the cell activity is required. After solving the this problem, the study for monitoring the cell activity and feed-back control of phosphate have to be performed.
Successful on-line computer process control and optimization of fermentation processes, especially the ones utilizing recombinant cells, have been impeded by the lack of dependable instruments for the measurements of physical and biochemical variables in bioreactors and also by the absence of proper mathematical models necessary for establishing meaningful strategies to control bioprocesses. Many studies were done to overcome these problems but research works on the computer control for on-line induction of recombinant bioprocesses could hardly be seen. In present study new software and harclware were developed and the on-line induction optimal control of recombinant cell bioprocesses, by personal computer was successfully carried out. The developed software could preeisely control the dissolved oxygen and the on-line optimal induction could successfully be performed by using the self-constructed interface. Moreover other variables such as proton concentration, temperature and RQ with help from external analog controllers, could also be online computer-controlled in any desired fashion and the on-line computer control of fed-batch fermentation could be done at will. As the analyzer data of gases such as oxygen and carbon dioxide could easily be fed into the computer, the number of the sample variables accepted by the computer is easily increased. By simply exchcmging with better cluality hardware such as mass spectrometer more precise and wider-spectrum computer control could be exercised in on-line mode.
Although there are many reaction systems to utilize the lipase more efficiently, the denaturation of the enzyme is one of the most serious problems to be solved in all systems tried to date. The kinetics of the Candida rugosa lipase deactivation was foundto be a complex process, which consisted of the three regions; 1) initial lineal region, 2)transie.nt region, and 3)last linear region. Baseed on above result, Candida rugosa lipase solubilized in organic solvents (e. g. in "reversed micel lar system " or "reverse phase system")could catalyze the hydrolysis of triglycerides and kinetic analysis of the lipase-catalyzed reaction was found to be possible in these systems. And then, the characteristics of the batch and continuous glycerolysis of triglyceride by Chromobacterium viscosum lipase were studied in reversed micellar system.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...10
• 제 2 장 연 구 방 법...13
• 제 3 장 결 과...22
• 제 4 장 결 론...51
• 제 5 장 참고문헌...53