초록 ▼

효소표지항체법을 이용하는 한타바이러스의 플라크 형성방법을 확립하고 이를 이용하는 몇가지 연구를 통해서 한타바이러스의 플라크분석과 응용에 관한 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 항체- 효소항체계는 항한타바이러스 쥐항체와 peroxidase가 부착한 항 쥐IgG였으며 효소기질은 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrohloride를 사용하였다. 2. 바이러스감염세포를 유지배양하고 분리된 플라크형성을 위해서 배양액은 methyl cellulose를 함유하는 반유동배지를 사용하였다. 3. 본 면역효소플라크 분석법

효소표지항체법을 이용하는 한타바이러스의 플라크 형성방법을 확립하고 이를 이용하는 몇가지 연구를 통해서 한타바이러스의 플라크분석과 응용에 관한 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 항체- 효소항체계는 항한타바이러스 쥐항체와 peroxidase가 부착한 항 쥐IgG였으며 효소기질은 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrohloride를 사용하였다. 2. 바이러스감염세포를 유지배양하고 분리된 플라크형성을 위해서 배양액은 methyl cellulose를 함유하는 반유동배지를 사용하였다. 3. 본 면역효소플라크 분석법 (immunoenzyme plaque assay)에서 항체 및 효소표지항체의 최적사용단위는 4 ∼ 8 unit 였으며 그 이상과 그 이하에서는 강한 배경염색으로 인한 대비의 불량 및 플라크자체의 발현 불량등으로 부적합하였다. 4. 플라크형성에서 최적 methyl cellulose농도는 한탄 바이러스는 0.6%, 프로스펙트힐바이러스는 0.4%로서 바이러스의 성장속도에 따라 최적농도가 다름을 알 수 있었다. 5. 플라크형성의 최적시기는 한탄바이러스의 경우 4 ∼ 7일이었으며 7 ∼ 10일이었다. 6. 플라크 (immunoenzyme plaque)는 희석시험의 결과로서 최소한 한개의 바이러스입자에 의해 형성되었음을 알 수 있었으며 플라크의 현미경 관찰결과 바이러스항원에 대한 항체 및 표지항체의 반응 및 기질과의 반응결과로서 불용성의 반응생성물이 퇴적된 감염세포의 집단임이 확인되었다. 7. immunoenzyme plaque와 한탄바이러스와의 관련성 확인시험으로서 플라크감소중화시험 결과는 한국혈출혈열 환자 또는 항한탄바이러스 쥐혈청이 플라크의 수를 현저히 감소시킴이 관찰됨으로써 증명될 수 있었다. 8. 상기와 같이 개발 확립된 방법을 통해서 한타바이러스의 항원 분석, 신중후출혈열의 감별진단, 바이러스간섭시험들을 실시함으로써 그 유용성을 입증할 수 있었다.

Abstract ▼

The new method for formation of plaques of Hantaviruses was developed using the system of enzyme-labelled antibody and Vero-E6 cells maintained with semi-solid medium. To establish the method, several preliminary tests were carried out and consecutive studies were included for evaluation and practic

The new method for formation of plaques of Hantaviruses was developed using the system of enzyme-labelled antibody and Vero-E6 cells maintained with semi-solid medium. To establish the method, several preliminary tests were carried out and consecutive studies were included for evaluation and practical application. The obtained conclusions are as follows; 1. The method, immunoenzyme plaque assay, was constructed with l) anti-Hantavirus antibody and peroxidase labelled anti-rat IgG for antisera, 2) 3, 3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride for substrate and 3) Vero-E6 monolayer maintained with semi- solid methyl cellulose DMEM for virus propagation. 2. The optimal units of antibody and enzyme-labelled antibody were determined as 4-8 unit in both. Otherwise, at the higher or lower dilutions, it was not satisfiable in the contrast with background and the intensity of plaque staining. 3. The optimal concentrations of methyl cellulose in culture medium to form the countable, well sized plaques were 0.4% and 0.6% for Prospect Hill virus and Hantaan virus, respectively. 4. The plaques formed by this mathod was proved as to be produced by at least one virus particle according to the result of virus dilution experiment. Also, the observation of plaque by light microscope revealed that the plaque is the group of cells bearing viral antigens which were deposited with reaction product produced histochemically. 5. To determine whether plaques are formed by Hantaan virus, the virus was mixed with either sera from the patients of KHF or sera of rats immunized with Hantaan virus. The positive neutralization was evident by remarked reduction of numbers of plaques. 6. The sensitivity, specificity and usefulness of the method could be proved by being applied in differential diagnosis of HFRS, analysis of Hantaviral antigens, test for virus interference and massive screening of neutralizing antibody- or virus titration.

목차 Contents

• 1. 서론...5
• 2. 재료 및 방법...8
• 2.1 바이러스...8
• 2.2 조직배양세포...9
• 2.3 항혈청의 준비...9
• 2.4 Immunoperoxidase plaque assay...10
• 2.5 각종 한타바이러스 재료로부터의 바이러스 역가분석...13
• 2.6 플라크감 소중화항체가의 측정...13
• 2.7 한탄 및 프로스펙트힐바이러스의 동시 감염시 간섭작용...15
• 3. 결과...15
• 3.1 면역효소플라크 분석법의 확립...15