초록 ▼

고등 식물에서 외래 유전자를 발현시키기 위해 이용되는 몇가지 promoter중 가장 강력하고 널리 사용되는 것이 cauliflower mosaic virus(CaMV)35S promoter이다. 본 연구의 목적은 중요한 작물의 하나인 감자에서 각 기관 및 세포 유형에 따른 35S promoter의 발현 양상과 발현의 정도, 외래 유전자의 유전적 안정성 및 절단된 옥수수 탈수소효소 유전자의 인트론이 35S promoter의 발현에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 본 연구를 수행하기 위해 절단된 인트론을 갖지 않는 유전자 전달

고등 식물에서 외래 유전자를 발현시키기 위해 이용되는 몇가지 promoter중 가장 강력하고 널리 사용되는 것이 cauliflower mosaic virus(CaMV)35S promoter이다. 본 연구의 목적은 중요한 작물의 하나인 감자에서 각 기관 및 세포 유형에 따른 35S promoter의 발현 양상과 발현의 정도, 외래 유전자의 유전적 안정성 및 절단된 옥수수 탈수소효소 유전자의 인트론이 35S promoter의 발현에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 본 연구를 수행하기 위해 절단된 인트론을 갖지 않는 유전자 전달 벡터(pB1121)와 CaMV 35S promoter-절단된 인트론-β-glucuronidase(GUS) 유전자 구조로 재조합한 유전자 전달 벡터 각각을 감자의 경우, A. tumefaciens를 매개로 하여 괴경조직을 대상으로 형질전환을 유도하고 이들의 후대에서 35S promoter의 발현을 조사하였다. 또한 주 식량자원인 벼 형질전환 개체의 유도에 적합한 유전자 전이 방법을 연구하고자 벼 원형질체를 대상으로 하여, PEG를 매개로하는 유전자 전이 방법과 입자 사출 방법을 통한 유전자 전이 방법을 시도하여 형질전환된 캘러스와 재분화 개체를 획득하였다.
감자의 형질전환 연구에서, 재분화 유도과정에서 생기는 체세포 변이 유발 가능성을 중이기 위해 캘러스 과정을 거치지 않고 직접 기관 발생을 유도하여 배양 3주후 shoot를, 배양 8주후 완전한 형질전환 개체를 선발하였고, 3-4개월 후 정상적인 성체 식물로 유도하였다. X-gluc를 기질로 한 조직화학적 염색 결과 형질 전환된 개체의 줄기, 엽병, 근경, 뿌리의 횡단변 관찰에서 CaMV 35S promoter에 의한 GUS 유전자의 발현은 유관속형성충 주위에서, 괴경에서는 전반적으로 발현되었으나 promedular 주위에서, 뿌리에서는 근단에서만 강력한 발현을 보여 35S promoter는 분열이 활발한 세포에서 강한 발현을 나타냄을 알 수 있었다. 생식 기관인 수술과 암술에서도 GUS유전자는 발현되었고 꽃잎과 잎에서는 엽맥을 따라 강한 발현을 보였다. 영양 번식을 하는 감자에서 외래 유전자의 유전적 안정성을 조사하기 위해 형질 전환 개체의 4세대 후대까지 조사한 결과 모든 개체에서 외래 유전자가 발현됨을 확인하였고, 감자 염색체로 삽입된 외래 유전자의 copy수는 한개 수준이었다. 또한 이들 후대에서 형태적 변이가 거의 일어나지 않아 감자에 서 A. tumefaciens를 매개로 한 외래 유전자의 도입이 변이 유발을 일으키지 않음을 알 수 있었다. 절단된 옥수수 탈수소효소 유전자의 인트론이 35S promoter의 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해 절단된 인트론을 갖지 않는 구조의 유전자 전달 벡터(pB1121)로 형질전환된 개체를 대조구로 하여 GUS 효소 활성을 조사한 결과, 절단된 인트론을 갖는 구조의 벡터가 잎, 줄기, 뿌리에서 각각 30,34,42배 높은 활성을 나타내서 절단된 인트론이 35S promoter의 발현을 증대시킴을 알 수 있었다.
벼의 형질전환은 1)원형질체를 대상으로, PEG를 매개로한 외래 유전자 도입 방법, 2)작은 세포괴를 대상으로, PEG를 매개한 외래 유전자 도입 방법, 3)배발생 켈러스를 대상으로 한 입자 사출 방법에 의해 외래 유전자를 도입하는 방법을 수행하였다. Feeder cell layer 방법을 이용하여 PEG 매개에 의한 원형질체의 치상 효율은 0.49% 이였고, 형질전환 효율은 0.015%였다. 작은 세포괴를 이용한 방법에서는 세포 0.5g 당 2 개의 형질전환된 유식물체를 얻었다. 입자 사출방법에 의한 유전자 도입에서, 캘러스 0.5g 당 1205개의 외래 유전자가 일시적으로 삽입, 발현되었고 이중에서 50개의 형질전환된 캘러스를 획득할 수 있어 가장 높은 형질 전환 효율을 나타내었다. 형질전환된 벼 유식물체에서 조직화학적 GUS 분석과 DNA 혼성화 반응을 통해 외래 유전자가 안정적으로 도입되었음을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼

We examined the expression pattern of the cauliflower masaic virus(CaMV) 35S promoter at various organs of the transformed plants, genetic stability of the foreign gene in the progenies, and the effect of the deleted maize alcohol dehydrogenase(Adh) 1 intron to the expression of the 35S promoter in

We examined the expression pattern of the cauliflower masaic virus(CaMV) 35S promoter at various organs of the transformed plants, genetic stability of the foreign gene in the progenies, and the effect of the deleted maize alcohol dehydrogenase(Adh) 1 intron to the expression of the 35S promoter in the transgenic plants. Also, we studied on the gene transfer methods to the rice. We reconstructed a serize of gene transfer vector which contains the 35S promoter, the deleted Adh 1 intron, β-glucuronidase(GUS) gene as a reporter gene, and neomycin phosphotransferase gene(NPT II) and hygromycine phosphotransferase(hpt) gene as a selective marker for dicotyledonous and monocotyledonous plant. Induction of the transformed potato, A. tumefaciens used as a intermediator. To avoid somaclonal variation during in vitro culture, we induced direct shoot from the tuber dics. After 8 week culture, we obtained regenerated explant in the selective medium and transferred to pots for hardening. After 3-4 months culture, matured transgenic plants were obtained.
To understand the expression patterns of the 35S promoter, we examined histochemical staining at various organs of the transgenic plants. Cross section of stem, petiole, root and rhizome showed the GUS activity was primarily expressed aroud vascular cambium. In situ assay of the GUS expression at tuber, the Gus activity was expressed whole region. To confirmed the copy number of foreigen gene in transgenic potato, we carried out Southern hybridization with GUS coding region. In this study, a single copy of foreign gene was introduced into the potato chrmosomes. Morphological observation and chromosome counting in the progeny of the transgenic potato, there was no somaclonal variation and the GUS gene was expressed to the fourth generation. The quantitative spectrophotometric assay showed that the level of GUS activity in potato transformed with pLS201(contains the deleted Adh 1 intron) was higher in leaf, stem and root by 30-, 34- and 42-fold, respectively than those on potato transformed with pB1121(without deleted Adh 1intron).
We assessed three methods of gene transfer system for tice transformation ; 1) PEG-mediated protoplasts transformation system. 2) PEG-mediated small cell colony transformation system, 3) DNA-coated particle bombardment system. In the transient assay of GUS, the highest confirmed efficiency was obtained in the third method. Also, we confirmed the GUS gene was introduced into the rice chromosomes by DNA slot blot hybridization.

목차 Contents

• 1. 서론...10
• 2. 재료 및 방법...12
• 3. 결과 및 고찰...19
• 4. 인용문헌...45
• 논문발표실적...47
• 학위배출시적...47
• 연구비 항목별 집행내역...48