초록 ▼

동물 세포의 중식 촉진인자로서 세포외성 중식 자극 인자에 대해서는 그간 많은 연구가 진행되어 상당 부분의 경우 그 유전자가 클로닝되고 그 작용 기작이 일부 밝혀졌으나 아직도 세포내성 증식 촉진 인자 (MPF)에 관하여서는 그 성상, 구조의 특징, 생리적인 활성 조절 및 그 작용 기전에 대한 연구가 기초적인 수준에 머물러 있다. 본 연구에서는 동물 세포의 증식 분화의 연구에 가장 이상적인 in vivo 연구 모델로 밝혀진 간세포 재생모델을 연구대상으로 하여 본 연구팀들이 지난 수년간 연구한 결과를 바탕으로 간세포 재생 과정중 간세포

동물 세포의 중식 촉진인자로서 세포외성 중식 자극 인자에 대해서는 그간 많은 연구가 진행되어 상당 부분의 경우 그 유전자가 클로닝되고 그 작용 기작이 일부 밝혀졌으나 아직도 세포내성 증식 촉진 인자 (MPF)에 관하여서는 그 성상, 구조의 특징, 생리적인 활성 조절 및 그 작용 기전에 대한 연구가 기초적인 수준에 머물러 있다. 본 연구에서는 동물 세포의 증식 분화의 연구에 가장 이상적인 in vivo 연구 모델로 밝혀진 간세포 재생모델을 연구대상으로 하여 본 연구팀들이 지난 수년간 연구한 결과를 바탕으로 간세포 재생 과정중 간세포 MIPF의 활성 조절을 위한 Signal Transduction 기작, MPF 분리 정제를 통한 단백질 구조 및 생화학적 특성과 MPF cDNA 의 클로닝과 그 유전자 분석을 통하여 MPF gene 이 간세포 재생 기간중에 어떤 기전을 통하여 발현 조절되는가에 대한 기초적 자료를 얻고자 하였다.
본 연구 목적을 달성하기 위하여 각 세부과제에서 수행한 연구 결과를 요약하면 다음과 같다.
제 1 세부과제 수행 결과는 다음과 같다. 간조직으로부터 추출한 단백질을 Ammonium Sulfate 분획, S Sepharose, Casein Agarose Chromatography을 통해 870배의 정제도로 정제하였으며, 이 효소의 최적 온도는 30℃였고 기질의 특이성, 저해제의 특이성, Western blot analysis 를 통해 부분 정제된 효소가 cdc2 kinase (MPF) 임을 확인하였다.
제 2 세부과제 수행 결과는 다음과 같다. 흰쥐의 간 조직 내에서 cdc2 및 cyclin 유전자의 구조 및 발현 조절 기작을 규명하기 위하여 그 cDNA 와 genomic DNA를 클로닝하였다. 흰쥐 간의 cDNA library 로부터 cdc2 cDNA를 클로닝하였는데 cdc2 cDNA는 전체길이 1061 염기로서, 894 개의 아미노산 코드 부분, 25 개의 5' 비코드 염기서열, 그리고 164 개의 3' 비코드 염기서열로 구성되어 있었다. 흰 쥐의 cdc2 cDNA를, 인간과 생쥐의 cdc2 cDNA와 비교 분석한 결과 염기서열 수준에서 각각 84.6%, 94.1% 의 상동성을 보였으며 아미노산 서열 수준에서는 각각 97.6%, 99.3% 의 상동성을 나타내었다. 또한 흰 쥐 간의 cDNA library로부터 중합 효소 연쇄 반응 (PCR : polymerase chain reaction)에 의하여 cyclin A 및 cyclin B cDNA를 부분적으로 클로닝하였다. 클로닝된 195 bp 크기의 cyclin A 및 cyclin B cDNA 절편에 대한 염기서열과 아미노산 서열을 분석해 본 결과, 흰 쥐의 cyclin A cDNA는 인간의 cyclin A cDNA는 인간의 cyclin A cDNA와 염기 및 아미노산 서열 수준에서 각각 94.2%, 100%의 상동성을 보였다. 그리고 흰 쥐의 cyclin B cDNA는 인간의 cyclin B cDNA와 염기 서열과 아미노산 서열 수준에서 각각 96.4%, 95.4%, 생쥐의 cyclin B cDNA와는 각각 91.8%, 92.3%의 상동성을 나타내었다. 또한 간 부분 절제 후 재생되는 흰 쥐의 간 조직에서 세포 증식 주기에 따른 cdc2 유전자의 발현 정도 및 p34(sup)(cdc)? 인산화 효소 (kinase)의 활성을 측정하였다. Cdc2 mRNA 수준은 S phase에 진입할 때까지 낮았으나 S 와 G2 phase동안에 증가하였고 M phase 동안에는 감소하였으며 M phase 말기에 매우 낮았다. 또한 p34(sup)(cdc)? 인 산화 효소 활성의 변화 형태도 cdc2 mRNA 의 발현의 변화 형태와 유사하였다.
제 3 세부과제 수행 결과는 다음과 같다. 첫째, 흰쥐 간 재생 기간 중 d,lpropranolol 투여에 의해 DNA 합성이 억제된 결과를 토대로 DNA합성 유도 기전에 있어 PKA, PKC, MPF에 의한 신호전달 조절의 효과를 알아보기 위하여 약물 투여결과 대조군에서 [?H]-thymidine uptake 와 MPF, PKA, PKC 활성을 비교 측정하였다. 핵내 PKA, PKC 활성이 각각 부분 간 절제 후 14, 18 시간에 최대치를 보였으며 이들은 d,l-propranolol 처리에 의해 저해되었다. MPF 활성은 G1/S 전환 시기인 부분 간 절제 후 18 시간과 mitosis인 30 시간에 증가되었으며 이 활성 증가는 d,l-propranolol 처리에 의해 6시간 지연되었다. 부분 간 절제 후 20 시간에 최대를 보이는 DNA 합성능도 역시 d,l-propranolol 처리에 의해 6-8시간 지연되었다. 둘째, 흰쥐 일차배양 간세포에 PKC inhibitor인 staurosporine 처리에 의해 DNA 합성이 저해되었고 동시에 cdk2 kinase의 활성이 지연, 저해됨을 관찰하였다. PKC stimulator 인 PMA 처리에 의해서 DNA 합성이 대조군에 비해서 증가되었으며 동시에 cdk2 kinase 활성 증가가 대조군에 배해 더 빠른 시간에 관찰되었다. 셋째, 흰쥐 재생 간 조직에서 세포분열에 깊이 관련되어있는 cdc2 kinase와 c-src protein tyrosine kinase의 활성이 시간적으로 서로 연관되어 있음을 관찰하였다. 따라서, 이상의 실험 결과들로부터 흰쥐 재생 간조직과 일차 배양 간세포에서 DNA 합성 조절에 MPF가 관련되어 있으며, 그 활성은 Protein kinase A 또는 Protein kinase C 를 경유한 신호전달체계에 의해 조절될 가능성을 확인하였다.
제 4 세부과제 수행 결과는 다음과 같다. 일반적으로 Ki-ras 유전자 발현은 K-ras exon 4b만 발현이 되고 exon 4a는 발현이 안되는데, 부분 간 절제 수술 후에는 오히려 exon 4a만 그 발현이 증폭되고 exon 4b의 발현은 변화가 없었다. 이상의 실험으로 부분 간 절제 수술 후의 K-ras 유전자 발현이 수술전보다 크게 증폭되며 또한 RNA splicing pattern도 바뀌게 됨을 간접적으로 증명하였다. K-ras 유전자의 염기 서열은 사람과 생쥐에서 완전하게 알려져 있는데 흰쥐의 경우에는 exon 1과 exon 2만이 그 염기 서열이 알려져 있었다. 본 연구실에서 클로닝한 rat K-ras cDNA의 exon 2의 3' 말단에서부터 poly A tail 까지 약 1 kbp 중에서 3' 말단으로부터 650 bp의 염기서열을 결정하였다. 450번부터 570번까지 120 bp는 이미 알려진 생쥐의 염기서열과 정확히 일치하였다. 흰쥐와 생쥐의 Ki-ras 유전자에 대한 염기서열을 비교하여본 결과 번역부분 (exon 1, 2, 3, 4B)에서는 98%의 유사성을 나타냈고, 전사는 되고 번역은 되지 않는 exon O의 경우에는 88%의 유사성을 나타냈으며 exon 4B 이후의 번역되지 않는 부분에서는 82%의 유사성을 나타냈다. 또한 흰쥐와 인간의 Ki-ras 유전자의 염기서열을 비교한 결과 exon1, 2, 3, 4B의 경우에는 94%, exon O의 경우에는 86%의 유사성을 나타냈다.
이상과 같이 본 연구를 성공적으로 수행함으로써 동물 세포의 증식, 분화에 중심적 역할을 하는 MPF가 간세포 재생 기간중 어떤 기작을 통하여 세포증식을 조절하는가에 대해 학문적으로 매우 중요한 정보를 제공할 수 있게 된 것으로 사료되며, 또한 기전의 연구 등 관련 분야에도 유용한 정보가 될 것으로 생각된다.

Abstract ▼

In recent years, the molecular action mechanisms and the structural features of extracellular growth stimulating factors and their receptors in animal cells have been intensively documented. However, the substrate specificities, the structural characteristics and the signal transduction pathways for

In recent years, the molecular action mechanisms and the structural features of extracellular growth stimulating factors and their receptors in animal cells have been intensively documented. However, the substrate specificities, the structural characteristics and the signal transduction pathways for the regulation of Maturation Promoting Factor (MPF), which is known to play a major role in the cell cycle regulation, are largely unknown.
Therefore, in this report, by utilizing the regenerating rat liver which has been proven to be an ideal in vivo model system for the study of animal cell proliferation, we attempted to perform the following experimental projects : the signal transduction mechanisms for the regulation of MPF activity during regeneration of rat liver, the purifiction and characterization of hepatocyte MPF and the cloning and analysis of cdc2, cyclin A and B cDNAs.
The experimental results of each subsidiary project are summarized in the following paragraphs.
The results of the first project are as follows: By ammonium sulfate fractionation and FPLC using S-Sepharose and casein agarose columns, the MPF was purified by 870 folds whose optimum temperature was 30℃ and this activity was proven to be cdc2 kinase (MPF) by substrate specificity, inhibitor specificity and immunoblot analysis. The results of the second project are as follows: Rat cdc2 cDNA was cloned from a rat liver cDNA library in λ(sub)(gt)ll vector. The cDNA was 1061 nucleotides long and composed of 894 bases, 25 bases and 164 bases for the coding, 5' noncoding adn 3' noncoding sequencs, respectively. Nucleotide sequence of the coding region and the deduced amino acid sequence for 297 residues shows 94.1% and 99.3% homologies to those of mouse cdc2. 195 bp fragment of cyclin A cDNA was cloned by PCR from the rat cDNA library. 195 bp fragment of cyclin B cDNA was cloned by the same method. When compared to human cyclin A, nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of rat cyclin A cDNA showed 94.2% and 100% homologies. Rat cyclin B cDNA sequence and the deduced amino acid sequence showed 96.4% and 95.4% homlogies to human cyclin B cDNA. Expression of cdc2 during the first cell cycle of rat liver regeneration after partial hepatectomy was investigated. The level of mRNA was low before entering S phase, increased during S and G2 phase to a maximum, decreased during M phase, and dropped to the background level upon exit from M phase. The pattern of p34(sup)(cdc2) cativity level change was similar to that of mRNA. Rat genomic DNA library was construced in λEMBL-3 vector. Genomic DNA clones of cdc2 and cyclin A genes were isolated from the library using the cDNAs as probes. The genomic DNA clones were partially mapped by Southern blot hybridization.
The results of third project are as follows. First, PKA and PKC-mediated regulations of MPF activity were incestigated in partially hepatectomized (PH) rat liver usign d, l-propranolol which has been shown to block the activity of DNA synthesis and the level of cyclic AMP in regeneration rat liver, and to directly inhibit PKC. The activities of hepartocyte nuclear PKA and PKC were observed to increase at 14 hrs and 18 hrs after PH. Both of these kinase activities were inhibited to the basal levels as a result of d,l-propranolol injection. The nuclear MPF activity was also increased at 18 hrs known as G1/S transition phase of PH rat liver but its peak activity was concomittantly delayed with DNA synthetic acitvity by 6 hrs in response to the injection of d,l-propranolol. Second, the PKA- or PKC- mediated regulatory mechanism of DNA synthetic activity via MPF were further examined in hepatocyte primary cultures. The results showed that staurosporine inhibited DNA synthetic activities and concomittantly delayed cdk2 kinase activities. In contrast, PMA induced cdk2 kinase activities earlier than those of control and increased DNA synthetic activities. Thirdly, we have shown that the activities of cdc2 kinase and c-src kinase were temporally related during regeneration of rat liver. From these results, we suggest that PKA and/or PKC may play an important role in the signal transduction pathway for the DNA synthesis in regenerating rat liver through phosphorylative modification of MPF during the G1/S transition phase.
The results of the fourth project are as follows: To determine the nucleotide sequences of exon 1, 3, 4A, 4B of the rat Ki-ras gene, we screened the rat liver cDNA library with the probe which encompassed all sequences of the Ki-ras exonl. The rat Ki-ras gene containing exon 0, exon 3. exon 4B was amplified using the PCR, subcloned and sequenced. A comparison of the rat gene with that of the homologous mouse Ki-ras gene revealed 98% nucleotide sequence homology within the coding regions, 82% homology for the untranslated region of exon4B and 88% homology for the untranslated exonO. Between the rat and human Ki-ras genes, there are only 33 differences among the nucleotides (94%) comprising the four potential coding exons 1, 2, 3, 4B. And in the untranslated exonO revealed a homology of 88%. To study the patternn of gene expression in normal and regenerating rat liver, total RNA was isolated from the normal and regenerating lives between 18- 36 hours after partial hepatectomy and reverse transcribed with AMV reverse transcriptase, amplified by RT-PCR, subcloned and sequenced. The nucleotide sequence of the rat cellular Ki-ras gene in normal and regenerating liver showed that there are quantitative differences, but no obvious qualitative differences between mRNA populations of normal and regenerating liver.
As shown above, the objectives of our study are attained on the whole and the results of our study will give the valuable informations with respect to the regulatory mechanism by which MPF, the major regulatory factor in the proliferation and differentiation of animal cell, act to influence the proliferation of rat hepartocytes during regeneration after partial hepatectomy. In addition, these results can be used as an useful basic data for the study of cancer.

목차 Contents

• 총괄목차...11
• 1장.서 론...12
• 2장.연구 방법...13
• 3장.결 과...14
• 4장.고 찰...21
• 5장.결 론...32
• 제 1세부과제...32
• 1장. 서 론...37
• 2장. 연구 방법...40
• 3장. 결 과...46
• 4장. 고 찰...60
• 5장. 결 론...62
• 6장. 참고 문헌...63
• 제 2세 부 과 제...95
• 1장. 서 론...97
• 2장. 연구방법...99
• 3장. 결 과...106
• 4장. 고 찰...131
• 5장. 결 론...134
• 6장. 참고문헌...136
• 제 3 세 부 목 차...140
• 1장. 서 론...141
• 2장. 연구 방법...155
• 3장. 결 과...167
• 4장. 고 찰...217
• 5장. 결 론...225
• 6장. 참고 문헌...226
• 제 4 세 부 과 제...237
• 1장. 서 론...239
• 2장. 연구 방법...242
• 3장. 결과 및 고찰...242
• 4장. 결 론...247
• 5장. 참고문헌...264