초록 ▼

종자를 자연건조 시킨 상태에서 GUS gene과 Hygromycin phosphotrasferase gene을 가진 plasmid DNA용액을 imbibition시켰다. GUS gene의 경우 벼의 품종, vector의 종류 imbibition의 조건에 따라 표지유전자의 발현율이 차이가 있었으며 약 40-60%의 transient expression을 나타내었다. 그 발현부위는 주로 세포분열조직인 생장점과 잎맥부위였다. Hpt gene vector를 이용한 결과 hygromycin media에서 30％의 생존률을 보였다. 선별된 개

종자를 자연건조 시킨 상태에서 GUS gene과 Hygromycin phosphotrasferase gene을 가진 plasmid DNA용액을 imbibition시켰다. GUS gene의 경우 벼의 품종, vector의 종류 imbibition의 조건에 따라 표지유전자의 발현율이 차이가 있었으며 약 40-60%의 transient expression을 나타내었다. 그 발현부위는 주로 세포분열조직인 생장점과 잎맥부위였다. Hpt gene vector를 이용한 결과 hygromycin media에서 30％의 생존률을 보였다. 선별된 개체의 genomic DNA를 뽑아 외부유전자의 존재를 dotanalysis를 통하여 확인하였다. 외래 Hpt gene copy 수의 부족으로 인한 Southen analysis의 한계를 PCR분석을 통하여 극복할 수 있었다. 즉 PCR결과 형질전환체에서 1.0 kb 크기의 DNA을 확인하였고 이를 다시 Southern analysis를 통하여 Hpt gene임을 확인하였다. long fragment DNA를 만들 수 있는 PCR을 통하여 genomic DNA내의 Hpt gene이 plasmid상태가 아님을 알았다.
식물을 형질전환시킬 수 있는 plasmid DNA는 대부분 한개의 표지유전자를 가지는 chimeric vector이다. 이 vector를 이용하여 식물의 형질전환의 여부를 가리기에는 부족한 점이 있다. 그래서 다른 표지유전자를 갖는 두 개의 vectors들을 이용하여 식물체를 cotransformation시켜 독립된 두 개의 유전자의 발현을 알아보는 방법이 있으나, 이 방법도 100％ cotransformation이 불가능한 제한점을 가지고 있다. 이러한 단점을 보완하여 GUS gene과 Hpt gene vector을 합친 fusion vector를 개발하였다. cloning을 통하여 각각 CaMV35S promoter와 NOS gene terminator 를 갖는 GUS gene과 Hpt gene을 붙히고 multicloning sites 를 갖는 약 10kb의 plant vector를 만들었다. Hpt gene를 이용하여 1차적으로 positive selection 하고 성체가 된 후에 GUS gene를 통하여 2차선별을 하여 완전한 형질전환체를 고를 수 있는 장점을 가지고 있다. 제한 효소를 통하여 vector DNA를 잘라 cloning의 여부를 알아보고 마지막으로 Southern analysis를 통하여 확인하였다. 이 DNA를 벼의 건조한 종자에 imbibition시켜 형질전환했을때, hygromycin media에서 선별한 결과 그 발현률은 single Hpt vector와 차이가 없었다. 또한 DNA와 total RNA를 추출하여 PCR분석과 cDNA를 이용하여 RT PCR 을 한 결과 외부 DNA가 들어가 발현되었음을 증명하였다.

Abstract ▼

Uptake of DNA in dry and viable embryos of rice by imbibition of DNA solution was detected by monitoring the expression of chimeric vectors.
The selective markers of expression vectors used were β-glucuronidase(Gus) and hygromycin phosphotransferase (Hpt) genes under the control of CaMV35S prom

Uptake of DNA in dry and viable embryos of rice by imbibition of DNA solution was detected by monitoring the expression of chimeric vectors.
The selective markers of expression vectors used were β-glucuronidase(Gus) and hygromycin phosphotransferase (Hpt) genes under the control of CaMV35S promoter. Frequency of expression of the foreign gene was generally 30-50％ varying according to the types of vectors and rice cultivars.
The main sites of Gus gene expression were meristems of roots and leaves. The DNA uptake of the Hpt gene in rice was demonstrated by PCR and Southern blot analysis. In PCR for long DNA fragments, we suggested that a Hpt gene in the transformant be stably integrated in genomic DNA of rice rather than via a plasmid.
Vector for plant transformation which had two reporter genes(Gus and Hpt genes) in a single plasmid was constructed. After rice embryos imbibed DNA solution, DNA uptake and gene expression in rice were monitored. Main expression sites of Gus gene were meristem of root and coleoptiles. There was no difference in Hpt gene expressions between a single Hpt vector and constructed vector in viability of rice in hygromycin medium after DNA imbibition. The genomic DNA and total RNA extracted from rice transformant survived in hygromycin medium were subjected to PCR and RTPCR analysis, respectively. As a result, we found the existence of Hpt gene and its expression in rice.

목차 Contents

• 제1장 서론...14
• 1절. 연구배경...14
• 2절. 연구목적 및 기대효과...21
• 제2장. 재료 및 방법...25
• 1절 벼의 형질전환 및 배양...25
• 2절 사용한 vector의 종류...25
• 3절 Hpt gene을 이용한 형질전환체 선별...26
• 4절 Gus gene을 이용한 형질전환체 선별...26
• 5절 DNA manipulaton...29
• 6절 Polymerase chain reaction(PCR)...29
• 7절 Inverse PCR(IPCR)...30
• 8절 IPCR products의 cloning과 sequencing...32
• 9절 Dot blot and Southern blot analysis...34
• 10절 재조합 vector의 개발...35
• 11절 벼로 부터의cDNA의 준비...36
• 제3장. 결과...38
• 1절 Gus gene expression...38
• 2절 Hpt gene expression...38
• 3절 Dot blot analysis, PCR 분석을 통한 벼의 genomic DNA의 분석...44
• 4절 재조합 vector의 제조와 발현...53
• 5절 재조합 vector를 이용한 형질전환체의 genomic DNA와 RNA의 분석...59
• 제4장. 고찰...62
• 1절 Gus gene과 Hpt gene이 발현...62
• 2절 PCR을 이용한 분자적 수준에서의 형질전환체의 분석...64
• 제5장. 결론...66