보고서 정보
주관연구기관 |
한국과학기술원 Korea Advanced Institute of Science and Technology |
연구책임자 |
김종득
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참여연구자 |
양지원
,
최태부
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1994-08 |
주관부처 |
과학기술부 |
사업 관리 기관 |
한국과학기술원 Korea Advanced Institute of Science and Technology |
등록번호 |
TRKO200200014774 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
PE)phosphatidylethanolamine).Amphotericin B.리포솜.독송.항진균성.무혈청배지.하이브리도마(A4W).유가식 배양.anti-$\beta$-HCG-Ab.항체-리포솜.HCG가 결합된 SRBC.PE)phosphatidylethanolamine).Amphotericin B.Liposomes.Toxicity.Antifyngal activity.Serum-free media.Hybridoma(A4W).Fed-batch culture.Anti-$\beta$-HCG-Ab.Immunoliposome.HCG coupled SRBC.
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초록
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제1세부과제에서는 곰팡이 세포내에 있는 chitin과 결합하고 세포벽을 분해하여 곰팡이 세포가 죽게하는 lysozyme을 이중층으로 삽입하기 위하여 lysoxyme에 소수성 지지대인 N-hyroxysuccinimide ester of palmitic acid(NHSP)를 공유결합 시켰다. 6시간동안의 반응동안 pH 8.0에서 lysozyme에 대한 NHSP의 최적몰비는 15였다. 수식된 lysozyme은 SDS-PAGE로 확인되었으며 최적조건에서 분자량은 수식되지 않은 lysozyme 보다 약 1500이 컸으며 glycochit
제1세부과제에서는 곰팡이 세포내에 있는 chitin과 결합하고 세포벽을 분해하여 곰팡이 세포가 죽게하는 lysozyme을 이중층으로 삽입하기 위하여 lysoxyme에 소수성 지지대인 N-hyroxysuccinimide ester of palmitic acid(NHSP)를 공유결합 시켰다. 6시간동안의 반응동안 pH 8.0에서 lysozyme에 대한 NHSP의 최적몰비는 15였다. 수식된 lysozyme은 SDS-PAGE로 확인되었으며 최적조건에서 분자량은 수식되지 않은 lysozyme 보다 약 1500이 컸으며 glycochitin에 대한 palmitoyl-lysozyme의 활성은 수식되지 않은 lysozyme의 35%였다. Palmitoyl lysozyme과 lysozyme 둘다 항진균활성을 띠었으나 palmitoyl lysozyme이 lysozyme보다 Candida albicans에 대해서 더 효과적이었다. 안정한 리포솜을 형성하기 위한 PE(phosphatidylethanolamine)에 대한 palmitoyl lysozyme의 최소 몰비는 2.4×10??이었으며 최적비는 약 2.4×10??이었다. 리포솜 막에 삽입된 pamitoyl lysozyme은 유리 palmitoyl lysozyme보다 Candida albicans에 대해서 더 효과적이었다. PC 리포솜에 삽입된 palmitoyl lysozyme은 PE 리포솜에 삽입된 것보다 독성이 적었으며 PC 리포솜에 함유된 수식되지 않은 lysozyme의 용혈능력은 PC리포솜에 공유결합된 그것과 비슷하였다. Palmitoyl lysozyme을 함유한 리포솜에 포집된 amphotericin B는 유리 amphotericin B와 lysozyme을 함유하지 않은 리포솜에 포집된 amphotericin B보다 Candida albicans에 대해서 더 효과적이었다. Amphotericin B의 항진균성을 유지하면서 약의 독성을 감소시키기 위하여 amphotericin B를 함유한 리포솜을 제조하는 새로운 방법이 고안되었다. 간략하게 요약하면, 새로운 방법은 감압하 4℃에서 메탄올과 클로로포름을 증발시킴으로서 amphotericin B와 egg PC(phophatidylcholine)을 PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.4)로 침전시키는 것이다. Amphotericin B의 농도가 30㎍ B/㎖ 일 때 37℃에서 17시간 동안 용혈현상을 관찰한 결과 3,6,9,12 그리고 15wt% amphotercin B를 함유한 새로운 방법으로 제조한 리포솜의 in vitro 독성은 종래의 방법으로 제조한 리포솜 독성의 약 30.1-50.1%정도였다. Amphotericin B 방출실험결과, 이와같이 새로운 방법으로 제조한 리포솜의 독성이 적게 나타나는 것은 amphotericin B가 새로운 방법으로 제조된 리포솜으로부터 적게 방출되기 때문이었다. 새로운 방법으로 제조된 리포솜이 독성을 적게 나타내는 것과 amphotericin B를 적게 방출시키는것은 새로운 방법에서 amphotericin B의 뭉침정도 (degree of aggregation)가 크기 때문인 것으로 추측된다. 새로운 방법으로 제조된 리포솜의 독성은 적었지만 Candida albicans에 대한 항진균활성은 종래의 방법으로 제조된 리포솜과 거의 같았다. 2세부과제에서는 값비싼 배양액을 효율적으로 이용하고 최종 항체농도를 높여 단일클론 항체의 대량생산에 응용할 목적으로 하이브리도마 세포의 유가식 배양을 이용하였다. 무혈청 배지의 개발은 다음 두가지 측면에서 그 중요성이 매우 크다고 볼 수 있는데, 첫째로는 고가의 혈청대신 값싼 무혈청 배지를 이용함으로써 하이브리도마 세포 배양의 비용을 현저히 낮출 수 있다는 점이고, 둘째로는 혈청을 사용할 경우 소의 혈청에서 유래된 다중클론 항체의 오염을 피할 수 없으나 무혈청 배지를 사용함으로써 다른 항체가 섞이지 않은 순수한 단일클론 항체를 생산할 수 있다는 점이다. 리포솜의 선택성 향상을 위해 리포좀 표면에 항체를 수식시킬 경우 여기에 사용하는 단일클론 항체의 순도가 매우 중요한 변수가 된다. 즉, 생산된 단일클론 항체가 혈청에서 유래된 다른 종류의 항체와 섞여 있다면 리포좀의 표적세포에 대한 선택성이 떨어질 뿐 아니라 본 연구에서 목표로 하는 표적 민감성 리포좀의 개발도 어려워 지게 된다. 본 연구에서 개발된 무혈청 배지 SF2(I/F+ethanolamine+transferrin)를 이용하여 하이브리도마 세포 A4W를 배양하였을 때 최고 세포농도는 혈청배지의 60% 수준에 머물렀으나 최종 항체농도는 94%로 형청배지와 유사한 수준의 항체 생산성을 나타내어 비교적 좋은 결과를 얻었다. 하이브리도마 세포의 유가식 배양은 회분식 배양의 낮은 항체생산성을 극복함과 동시에 대규모 배양에서 이용되는 관류식 배양의 복잡함을 피할 수 있는 장점이 있어 소규모의 항체생산에 매우 유리할 것으로 판단되어 유가식 배양법을 개발하기로 하였다. 먼저 유가식 배양에서 가장 중요한 배지의 공급방식은 배양기 내의 세포농도에 비례하여 첨가하는 방식을 택하였고 배지 조성은 glucose와 glutamine의 농도가 각각 2배씩 증가된 배지를 사용하였다. 회분식 배양에서 최종 항체농도는 65㎍/㎖ 인데 비해 유가식 배양에서는 배지 첨가속도에 따라 최종 항체농도가 134㎍/㎖에서 260㎍/㎖까지 최고 4배 가량 증가하였다. 또 반복 유가식 배양에서는 배지 첨가속도를 높이는 방법으로 3회까지 반복하여 배양함으로써 한번 배양을 시작하여 총 630㎎의 항체를 생산할 수 있음을 보였으며 이로써 리포좀 제조에 필요한 항체를 손쉽게 생산할 수 있는 길을 열어 놓았다. 끝으로 하이브리도마 세포 A4W가 생산하는 단일클론 항체, anti-β-HCG-Ab가 삽입된 PE 리포좀을 제조하고, 이 항체-리포좀을 인위적으로 준비한 표적세포, HCG가 결합된 SRBC와 liposome간의 결합에서는 calcein 방출이 뚜렷하게 일어났으나 HCG가 결합되지 않은 경우에는 SRBC 농도를 아무리 증가시켜도 calcein 방출이 일어나지 않았다. 이로부터 calcein 방출은 항체-리포좀과 SRBC 표면에 결합된 HCG간의 특이적 결합에 의해 일어남을 확인하였고 이로써 본 연구에서 목표로 하는 표적 민감성 리포좀이 만들어졌음을 확인할 수 있었다. 제3세부과제에서는 chitinase, glucanase, glucuronidase 와 같은 효소로 표면이 수식된 리포좀을 만들고 리포좀 내부에 Amphotericin B를 포집시킨 후 Candida albicans와 접촉시켜 약물 방출과 항진균력에 대하여 조사하였다. 이는 위의 효소가 진균과 결합할 경우 리포좀 내부에 포집된 Amp. B의 전달 효율이 높아지고 아울러 적혈구 세포막에 대한 Amp. B의 독성을 리포좀에 의해 감소시킬 수 있다고 생각하였기 때문이다. 실험결과 세 효소중 glucuronidase만이 진균과 결합하였으며 Amp. B의 항생효과는 크게 증가하지 않는 것으로 나타났다. 그 이유중 하나가 본 실험에서 사용한 리포좀이 진균과 결합후 리포좀의 형태가 변하여 약물이 방출되는 PE 리포좀이 아닌 평범한 PC 리포좀이었으므로 결합 후에도 약물전달이 크게 증가하지 않은 것으로 판단된다. PE를 이용한 Amp. B 리포좀은 제조하지 못하였다. 한편, Amp. B를 PC 리포좀내에 포집시켰을 때 Amp. B가 가지고 있는 적혈구에 대한 세포막 독성은 현저히 저하되었고 항생효과는 그대로 유지됨을 알 수 있었다. 예를 들어 치료제로 사용되고 있는 Amp. B 농도인 1×10??M에서 약 250㎍/㎖의 인지질을 이용하면 90% 이상의 독성이 감소되었다. 2차년도에는 다중클론 항체, anti-SRBC-antiserum을 포함하는 PE 리포좀을 제조하기 위하여 항체에 palmitic acid를 결합시키는 조건, 항체의 첨가량, 지질의 조성, 제조방법등을 조사한 결과 L. Huang이 제시한 방법과 거의 유사한 것으로 나타났다. 이로써 단일클론 항체나 다중클론 항체, 어떤 항체를 이용하든 immunoliposome의 제작이 가능한 것으로 보인다. 또 여기서 제작된 immunoliposome의 표적세포인 SRBC와 30분간 접촉시켰을?농도에서도 calcein이 방출되지 않아 calcein 방출이 항원-항체에 의한 특이적인 반응임을 확인하였다. 또 리포좀이 SRBC와 접촉한 후 약 10분이내에 calcein 방출의 90%가 진행되는 것으로 보아 여기서 제작된 리포좀이 표적 민감성 리포좀임을 알 수 있었다. 3차년도에는 단일클론 항체, anti-H-2b-antibody를 이용하여 표적 민감성 리포좀을 만들고 이 리포좀을 표적세포인 EL-4와 결합시켜 calcein 방출을 확인하였다. 이 리포좀에 항암제인 doxorubicin을 포집시키려 하였으나 DOPE만으로는 포집율이 낮았으므로 (2%미만), 리포좀을 좀 더 안정화 시키기 위하여 10% DOPA를 첨가한 결과 약물의 포집율을 25%까지 증가시킬 수 있었다. 이렇게 제조된 DOX-liposome을 표적세포인 EL-4와 접촉시켰을 때 세포생존율 곡선은 free-drug과 유사하게 나타났고, 비 표적세포인 Yac-1의 경우에는 free-drug에 비해 세포 생존율이 현저히 증가하여 비표적세포인 Yac-1이 리포좀을 이용할 경우 표적세포에 대한 선택적 악물전달이 어느 정도 가능한 것으로 보인다. 그러나 약물농도가 증가할 수록 비 선택적 약물전달 량도 증가하는 것으로 보이며 이를 극복하기 위해서는 세포와 리포좀의 접촉시간을 1시간 이하로 줄이든가 아니면 methotrexate와 같은 수용성 약물을 사용하여야 할 것이다.
Abstract
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In first part, The interaction of DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine) liposomes coated with palmitoyl lysozyme to fungal cells, were investigated, using lysozyme as a stabilizer for an unstable bilayer and a recognizer for a specific target cell. Lysozyme, which interact with chitin in the funga
In first part, The interaction of DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine) liposomes coated with palmitoyl lysozyme to fungal cells, were investigated, using lysozyme as a stabilizer for an unstable bilayer and a recognizer for a specific target cell. Lysozyme, which interact with chitin in the fungal cell wall, lyse the chitin and kill the cells, was acylated with N-hydroxylsucciniminde ester of palmitic acid(NHSP), and incorporated into the lipid bilayer. Lysozyme was optimally modified where the ratio of NHSP:lysozyme were 15 at pH 8.0, and for 6 hr. modified lysozyme was detected by SDS-PAGE, and its molecular weight was about 1500 greater than that of the intact lysozyme, when the ratio of NHSP to lysozyme was 15. The activity palmitoyl-lysozyme had and antifungal activity, but p-lysozyme was mere effective against Candida albicans than intact lysozyme was. The minimal molar ratio of p-lysozyme to PE(phosphatidylethanolamine) for stable liposomes was 2.4×10??, and the optimal ratio was about 2.4×10??. Palmitoyl lysozyme inserted into the PC liposome was less toxic than that into the PE liposome, and hemolytic ability of native lysozyme-containing PC liposome showed similar pattern with lysozyme coupled PC liposome. Palmitoyl lysozyme inserted into the PC liposome was less toxic than that into the PE liposome, and hemolytic ability of native lysozyme-containing PC liposome showed similar pattern with lysozyme coupled PC liposome. Palmitoyl-lysozyme containing liposomal amphotericin B formulation was more effective to Candida albicans than free amphotericin B and liposomal amphotericin B. On the other hand, a new method for preparing amphotericin B (AmB)-containing liposomes were developed to reduce the toxicity of the drug and egg phosphatidylcholine (PC) into phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4) or Tris buffered saline(TBS, pH 7.4) by evaporating methanol and chloroform around at 4℃ under reduced pressure. The hemolytic ability of the liposomes prepared by precipitation method at 37℃ at the dose of 30㎍ AmB/㎖ for 17hr was 30.1 to 50.3% of that of the conventional. The less toxicity of new liposomes would come from the higher aggregation of AmB indicated by circular dichroism (CD) around 330㎚. Despite a lower toxicity of the new liposomes, its activity against Candida albicans was almost equipotent with that of the conventional. Thus, the less toxic but the equally active liposomes containing AmB could be obtained by the precipitation method. In the second part, three kinds of works were carried out. for the first year, a serum free media, SF2, for the culture of hybridoma A4W, was developed. Serum free media is very important for the mass culture of hybridoma, because the price of serum is usually very high and serum proteins induce many problems in the purification processes of monoclonal antibodies. For the preparation of antibody containing liposme(immunoliposome), the high purity of antibody is indispensible. The final antibody concentration produced in serum free media was not less than that of serum containing media, about 90%. Thus prepared dox-immunoliposome was contacted with the specific cell, EL-4 or non-specific cell, Yac-1. In the case of EL-4, the cell viability of EL-4 treated with dox-liposome was not different from that of the cell treated with free drug. However, in the case of Yac-1, the cell viability of Yac-1 treated with dox-liposome was superior to that of the cell treated with free-dox. This result confirms that the target-sensitive liposome can protect the non-specific cells from the toxicity of drug through selective delibery of drug. In the second year, a process for the fed-batch culture of hybridoma was studied. One of the most important variable in fed-batch process would be the media feeding rate. The media feeding rate was found to affect on the hybridoma cell density, cell viability and the specific antibody production rate, thus final antibody concentration. In our work, when the media feeding rate was changed proportionally to the cell density in culture broth, the specific antibody production rate was trupled. The final concentration of antibody produced in fed-batch culture was almost four times that of batch culture. In the third year, repeated fed-batch process was also developed by enhancing the cell viability in the later part of culture. The total amount of antibody produced by 3 times repeated fed-batch culture was about 630㎎, which is an ample amount for the preparation of liposome of 400㎖. Finally, the monoclonal antibody thus produced, anti-β-HCG-antibody, was employed for the preparation of immunoliposome. This liposome containing calcein as a market together, calcein was released up to 65% of total amount, while no calcein release was observed for the SRBC without HCG. This result confrims that the target-sensitive immunoliposome was succesfully prepared. In the third part, three kinds of protein containing liposomes were prepared and their characteristics were studied. For the first year, glucuronidase containing PC liposome was prepared for the enhanced delivery of Amphotericin B to Candida albicans. The enzyme coupled liposome was found to have some affinity to the fungi, however, the delivery of drug was not greatly increased. This seems to be due to the PC liposome, of which structure is very stable. When Amp. B was entrapped into the PC liposome, the toxiciy of Amp. B to red blood cell(RBC) membrane was reduced by more than 90%, while its anitfungal activity to Candida albicans was not changed. For the second year, anti-SRBC-antiserum containing PE liposome, an immunoliposome, was prepared. The conditions for the preparation of immunoliposomes made with polyclonal antibodies were not different from those of liposomes made with monoclonal antibodies. When the prepared liposome was contacted with target cell, SRBC for 30 minutes, 40% of the entrapped calcein was released. As the release of calcein was processed up to 90% within 10 minutes, the immunoliposome might be a target-sensitive liposome. For the third year, anti-H-2b antibody containing PE liposome was prepared and when the target cell, EL-4 was contacted with the immunoliposome, the release of calcein was again realized. The entrppment of doxorubicin, an anticancer agent, was ameriorated by adding 10% of DOPA to PE liposome. Thus prepared dox-immunoliposome was contacted with the specific cell, EL-4 or non-specific cell, Yac-1. In the case of EL-4, the cell viability of EL-4 treated with dox-liposome was not different from that of the cell treated with free drug. However, in the case of Yac-1, the cell viability of Yac-1 treated with dox-liposome was wuperior to that of the cell treated with free-dox. This result confirms that the target-sensitive liposomes can protect the non-specific cells from the toxicity of drug through selective delivery of drug.
목차 Contents
- 제 1 장 서 론...13
- 제 2 장 연구방법...13
- 제 3 장 결 과...15
- 제 4 장 고 찰...18
- 제 5 장 결 론...19
- 제 6 장 참고문헌...20
- 제1 세부목차...25
- I. 서 론...29
- II. 연구방법...30
- 제 1 장. Lysozyme을 함유한 리포솜의 제조...30
- 제 1 절. Lysozyme의 수식 및 활성...30
- 1. Lysozyme의 수식...30
- 2. Lysozyme의 수식확인...30
- 3. 수식된 lysozyme의 활성...31
- 제 2 절.리포솜의 제조...32
- 1. 수식된 lysozyme을 포함한 리포솜의 제조...32
- 2. Lysozyme이 공유결합된 리포솜의 제조...33
- 3. 수식된 lysozyme과 amphotericin B를 함유한 리포솜 제조...33
- 제 3 절.Lysozyme을 함유한 PE리포솜의 특성화...34
- 1. 단백질 및 amphotericin B의 정량...34
- 가. 단백질 정량...34
- 나. Amohotericin B 정량...34
- 2. 독성 및 활성...34
- 가. In vitro 독성...34
- 나. 진균세포와 작용...35
- 제 2 장. 침전법에 의해 제조된 .amphotericin B를 함유한 리포솜의 독성과 항진균성...35
- 제 1 절. Amphoterinci B를 함유한 리포솜의 제조...35
- 1. 건조막의 수화에 의한 제조...35
- 2. 침전법에 의한 제조...35
- 제 2 절. 인지질과 amphotericin B의 분석...36
- 제 3 절. 독성과 활성...36
- 1. In virto독성...36
- 2. 항진균성...37
- 제 4 절. 리포솜의 물리적 특성...37
- 1. 안정성...37
- 가. Amphotericin B방출...37
- 나. Amphootericin B에 의한 calcein방출...37
- 2. 리포솜 입자의 침전...38
- 3. Circular dichroism...38
- 4. Size distribution of liposome by DLS...38
- 5. Amphotericin B와 egg PC의 침전...38
- III. 결과 및 고찰...39
- 제 1 장. Lysozyme을 함유한 리포솜의 제조...39
- 제 1 절. Lysozyme의 수식 및 활성...39
- 1. Lysozyme의 수식...39
- 2. P-lysozyme의 in vitro 독성...40
- 3. P-lysozyme의 항진균성...41
- 제 2 절. 리포솜의 제조...41
- 제 3 절. Lysozyme을 함유한 PE 리포솜의 특성화...42
- 1. Lysozyme을 함유한 리포솜의 in vitro 독성...42
- 가. P-lysozyme을 함유한 리포솜의 독성...42
- 나. Lysozyme이 공유결합된 리포솜의 독성...42
- 2. P-lysozyme을 함유한 리포솜의 항진균성...43
- 3. Amphotericin B P-lysozyme이 함유된 리포솜의 구조...44
- 4. Dynamic light scattering을 이용한 리포솜의 입자크기...44
- 5. Amohotericin B P-lysozyme을 포함한 리포솜의 in vitro독성...45
- 6. Amphotericin B P-lysozyme을 포함한 리포솜의 항진균성...45
- 제 2 장. 침전법에 의해 제조된 amphotericin B를 함유한 리포솜의 항진균성...46
- 제 1 절. Amphotericin B를 함유한 리포솜의독성과 활성...46
- 1. 독성...46
- 2. 항진균성...47
- 제 2 절. 리포솜의 물리적 특성...47
- 1. 안정성...47
- 2. Amphotericin B와 egg PC의 침전...48
- 3. 리포솜입자의 침전...48
- 4. Circular dichoism spectroscopy...48
- 5. Size distribution...49
- IV. 결론...50
- V. 참고문헌...51
- 제2부 목차...78
- 제 1 장 서론...80
- 제 2 장 재료 및 실험방법...83
- 제 1 절 무혈청 배지의 개발...83
- 1. 세포주와 배양액...83
- 2. 계대배양과 세포배양...83
- 3. 동결보관 및 해동...84
- 4. Stock solution 준비...84
- 5. 기본 배지의 준비...85
- 6. 세포증식 곡선과 세포농도 측정...87
- 7. 항체의 역가측정...87
- 제 2 절 하이브리도마 세포의 유가식 배양...87
- 1. 배양 장치...87
- 2. Glucose와 Ammonia 농도 측정...87
- 3. 유가식 배양...88
- 제 3 절 단일클론 항체의 분리및 정제...89
- 1. 이온 교환 크로마토 그래피...89
- 2. 친화성 크로마토 그래피...89
- 제 4 절 항체를 포함하는 PE 리포좀의 제조...89
- 1. 항체-리포좀의 제조...89
- 2. 항체-리포좀과 표적세포와의 결합...90
- 제 3 장 무혈청 배지의 개발...94
- 제 1 절 각 성분에 대한 최적농도 결정...94
- 제 2 절 각 성분이 중식에 미치는 영향...96
- 제 4 장 하이브리도마 세포의 유가식 배양법 개발...98
- 제 1 절 회분식 배양...98
- 1. 회분식 배양에서 하이브리도마 A4W의 증식과 단일클론항체 생성...98
- 2. Glucose와 Glutamine의 영향...99
- 3. 혈청농도가 세포증식과 항체 생성에 미치는 영향...100
- 제 2 절 유가식 배양...101
- 1. Time-dependent feeding mode...101
- 2. Growth-dependent feeding mode...103
- 제 3 절 반복 유가식 배양법의 개발...106
- 1. 배지 첨가속도가 세포 생존도에 미치는 영향...106
- 2. 세포 생존도 증가를 위한 배지조성...109
- 3. 반복 유가식 배양의 결과...111
- 제 5 장 항체-리포좀의 제조와 그 특성...113
- 제 1 절 단일클론항체의 분리 및 정제...113
- 제 2 절 HOG coy\upled SRBC의 제조...113
- 제 3 절 항체-리포좀과 표적세포와의 결합...114
- 제 6 장 실험결과 요약 및 결론...116
- 제 7 장 참고문헌...118
- 제3 세부 목차...154
- 제 I 장 연구목적...158
- 제 II장 효소를 포함하는 Amphotericin B의 제조와 특성화...159
- 1.서론...159
- 2.실험재료 및 방법...162
- 2.1.실험재료...162
- (1) $\beta$-Glucuronidase...162
- (2) 인지질...162
- 2.2.실험방법...162
- (1) Candida sp.의 배양...162
- (2) Free liposome의 제조...163
- (3) Liposomal amphotericin B(Amp.B)의 제조...163
- [1]Encapsulation Amp.B loposome의 제조...163
- [2]Intercalation Amp.B liposome의 제조...163
- (4) Calcein liposome의 제조...163
- (5) $\beta$-Glucuronidase가 포함된 Amp.B liposome의 제조...163
- (6) $\beta$-Glucuronidase가 포함된 liposomal calcein의 제조...165
- (7) Candida에 대한 Amp.B의 효과 측정...165
- (8) Liposomal caecein과 Candida와의 친화력 측정...165
- (9) Red Blood Cell(RBC)에 대한 Amp.B의 독성 측정...167
- (10) Enzyme의 activity 측정...167
- 3.실험결과 및 고찰...168
- 3-1. Liposome을 이용한 Amp.B의 독성 저하...168
- (1) DEAE-cellulose 이온교환수지를 이용한 $\beta$-Glucuronidase의 분리...168
- (2) Egg yolk로부터의 인지질 분리...169
- (3) Amp.Bdml Candida.중식저해 효과...170
- (4) DMSO가 liposome의 투과성에 미치는 영향...171
- (5) Lipid 첨가량에 따른 Amp.B의 독성저하...172
- (6) Amp.B 독성처하를 위하여 요구돠는 liposome의 양...172
- (7) Fungizone과 liposomal Amp.B의 항생효과 비교...174
- (8) Cholesterol이 liposomal Amp.B의 항생효과에 미치는 영향...176
- 3-2. $\beta$-Glucuronidase를 포함하는 liposome을 이용한 Amp.B의 독성 저하...178
- (1) $\beta$-Glucuronidase가 Candida의 생육에 미치는 영향...178
- (2) Free $\beta$-Glucuronudase가 Amp.B의 효과에 미치는 영향...178
- (3) NHSP/enzyme molar ratio에 따른 효소 활성의 변화...180
- (4) Enzyme coupled liposome 제조시 DOC의 첨가와 제거...180
- (5) $\beta$-Glucuroidase를 포함하는 liposome의 제조...182
- (6) $\beta$-Glucuronidase를 포함하는 Amp.B의 항생효과...183
- (7) $\beta$-Glucuronidase를 포함하는 liposome의 Candida에 대한 affinity...183
- 제 III 장 항체를 포함하는 표적민감성 리포좀의 제조와 표적세포와의 상호작용...185
- 1.서론...185
- 2.실험재료 및 방법...188
- 3.결과 및 고찰...200
- 3-1.Immunoliposome의 제조...200
- (1)항체가 삽입된 immunoliposome의 제조...200
- (2)IgG와 NHSP의 molar ratio에 대한 영향...202
- (3)p-IgG와 지질과의 molar ratio에 대한 영향...203
- (4)Final DOC에 의한 영향...204
- (5)수용성 마커인 calcein의 pH에 대한 영향...205
- (6)시간별 포집율의 변화...206
- (7)DOPA에 의한 영향...207
- (8)시간별 [p-IgG]/[Lipid] molar ratio에 따른 포집율의 변화...209
- 3-2.다중클론항체가 삽입된 immunoliposome의 제조...210
- (1)다중클론항체가 삽입된 리포좀의 제조...210
- (2)표적세포 SRBC와의 반응...211
- (3)DOPA농도에 의한 영향...212
- (4)시간에 따른 안정성...214
- 3-3.Anti-MHC I Ab를 이용한 암세포에 대한 약물전달...215
- (1)단일클론항체(monoclonal antibidy)의 선택...215
- (2)단일클론항체(monoclonal antibody)의 분리 및 정제...215
- (3)p-Ab가 삽입된 immunoliposome의 제조...216
- (4)Calcein을 이용한 immunliposome과 표적세포와의 반응성 결과...216
- (5)약물이 포집된 immunliposome과 제조 및 DOPA의 영향...216
- (6)암세포에 대한 약물전달...219
- 제 IV장 결론...220
- References...222
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