초록 ▼

제1세부과제에서는 보리수나무(Elaeagnus umbellata) 뿌리혹으로부터 공생균주인 Frankia EuIk1을 분리하였고, 이 균주로부터 게놈 DNA를 분리한 후 탐침을 이용하여 게놈 혼성화 반응을 수행한 결과 이 균주의 게놈에 nif 유전자가 존재함을 확인하였다. EuIk1 균주에 대한 게놈 library를 작성하고 여기에서 하나의 nif클론을 선별한 후 nifH와 D를 포함하는 DNA 절편을 플라스미드 벡터에 subcloning한 후 이들에 대한 염기서열을 결정하였다. Frankia EuIk1 균주의 nifH와 D를

제1세부과제에서는 보리수나무(Elaeagnus umbellata) 뿌리혹으로부터 공생균주인 Frankia EuIk1을 분리하였고, 이 균주로부터 게놈 DNA를 분리한 후 탐침을 이용하여 게놈 혼성화 반응을 수행한 결과 이 균주의 게놈에 nif 유전자가 존재함을 확인하였다. EuIk1 균주에 대한 게놈 library를 작성하고 여기에서 하나의 nif클론을 선별한 후 nifH와 D를 포함하는 DNA 절편을 플라스미드 벡터에 subcloning한 후 이들에 대한 염기서열을 결정하였다. Frankia EuIk1 균주의 nifH와 D를 다른 질소고정 미생물의 nifH 및 D와 비교한 결과 아미노산 서열과 염기서열 모두 서로 높은 상동성을 보였으며, 다른 Frnakia 균주와 같이 nifH와 D가 연속적으로 배열함을 알 수 있었다. 이울러 nifH promoter 서열이 밝혀져 앞으로 nif 유전자의 발현조절에 관한 연구에 도움을 줄 것으로 기대된다. 제2세부과제에서는 근류활성이 4월 중에 시작하여 6월초순과 9월중순에 각각 133 및 145μM C?H?/gdw/hr의 극대치를 보였고, 여름과 겨울에 활성이 없음을 확인하였다. 상대조도 20-25, 10-15 및 4-6％ 처리구의 질소고정활성은 대조구에 대해 각각 41,54 및 71％의 감소를 보였다. 근류를 15, 20, 25, 30 및 35℃에서 배양할 때 활성은 각각 5.7, 24.0, 43.0, 54.8 및 65.6μM C?H?/gfw nodule/hr로 변환하였다. 저온(15℃)의 전처리후 30℃로 옮겼을 때 근류활성(66.5μM C?H?/gfw nodule/hr)은 고온(35℃)전처리에 비해 촉진되었다. 근류의 활성은 산소 분압에 비례하여 16㎪이상에서 포화되었고, 근류를 뿌리에서 떼어내거나 절단하면 92％와 43％로 활성이 억제되었다. pH 5.5, 6.5 및 8.0에서 생육된 초기근류의 상대활성은 각각 89, 100 및 40％였으며, NO??-N 1, 3mM과 NH? 1, 3mM에서 생육된 초기근류는 각각 6, 1％와 68, 50％의 상대활성을 보였다. 수분공급량 20, 50 및 100mL에 의한 근류의 형성과 비활성은 각각 31, 120 alc 8㎎/plant와 33.6, 58.4 및 8.4μM C?H?/gfw nodule/hr였다. 식물체에 수분공급을 중단하여 일시위조가 나타났을 때 식물체의 함수량 및 증산량은 각각 90 및 53％ 감소되었으나, 근류활성은 완전히 소실되었다. 제3세부과제에서는 내륙과 도서에 분포하는 보리수나무와 해안에 분포하는 상록성인 보리밥나무, 보리장나무, 큰보리장나무, 녹보리똥나무 및 왕볼레나무의 분포지를 지도화하였고, 이들 보리수나무속 식물의 생육지와 토양환경요인을 분석하여 광생육지식물임을 확인하였으며, 보리수나무 생육습성으로서 식물계절을 조사하여 근류가 4-9월에 형성됨을 밝혔다. 뿌리와 근류의 수직분포가 사구에서 0-180㎝, 산지에서 0-30㎝, 석회암토양에서 0-20㎝ 깊이에 많이 분포함을 조사하였고, 굵은 뿌리무게와 근류무게 사이 또는 굵은 뿌리직경과 근류직경 사이에 양의 상관이 있음을 밝혔다. 뿌리근류가 형성되는 6가지 유형을 구분하였다. 부리수나무는 종자생산량 (3,300개 m?? yr??)이 많고 발아율 (52％)이 낮으며, 그 개체군 밑에 유성번식개체 (genet)가 발견되지 않고 4가지 유형의 무성번식개체(ramet)를 형성하여 한개체가 1-67줄기/그루터기로 분지하는데 줄기의 수명이 약 20년으로서 무성번식개체로 개체군을 유지하였다. 근계에서는 8-9월에 1,154㎎ NH??/g resin과 371㎎ No??/g resin의 질소를 배출하였다. 무질소-Frankia무접종, 무질소Frankia접종 및 유질소-Frnakia접종한 유식물의 생장이 100:131:119로서 무질소-Frnakia접종에서 왕성하게 자람을 밝혔다. 보리수나무 유식물을 채석장, 석탄폐광산 및 공업단지 주변과 같은 훼손된 생태계에 식재한 후 잘 활착하여 생장함을 밝혔다.

Abstract ▼

In the first subject attempted molecular biological approach, a Frankia EuIk1 strain was isolated from root nodules of Elaeagnus umbellata. Genomic Southern hybridization showed the existenceof nifH and D gene on the genome of this strain. We constructed a genomic library of this strain and isolat

In the first subject attempted molecular biological approach, a Frankia EuIk1 strain was isolated from root nodules of Elaeagnus umbellata. Genomic Southern hybridization showed the existenceof nifH and D gene on the genome of this strain. We constructed a genomic library of this strain and isolated a nif clone. Two DNAfragments hybridized with DNA probe (nifH and D of K. pneumoniae) were subcloned to plasmid vector and nucleotide sequences of these subcloneswere determined. The deduced amino acid and nucleotide sequence of nifHand D gene from Frankia EuIk1 were high similarity with those of othernitrogen-fixing microbes. We also found that nifH and D gens of EuIk1strain were contiguous, this result was in agreement with the nif gene organization in other Frankia strains. The nucleotide sequences of nifH promoter were determined and we consider the possible role of thenifH promoter in regulating the expression of nif gene. In the secondsubject attempted physiological approach, the acetylene acitivity of perennial root nodules of autumn olive plant showed two peaks of 133 and145μM C?H?/gdw/hr in June and September. Seedling showed the maxiumnitorgenase activity (NA) of 72.5μM C?H?/gfw nodule/hr with at earlier nodulation stage. Light conditions of 20-25, 10-15 and 4-6％ resulted indecreases of 41,54 and 71％ of the nitrogenase activity, respectively. Nodules incubated in the temperature of 15, 20, 25, 30 and 35℃ showed the activities of 5.7, 24.0, 43.0, 54.8 and 65.6μM C?H?/gfw nodule/hr, respectively. Pretreatment with low temperature(15℃) followed incubation at 30℃ attained higher nitrogenase activity(66.5μM C?H?/gfw nodule/hr) than that with higher temperature(35℃). Ambient oxygen(above 16㎪) is necessary for saturation of the nodule activity. but the activity was inhibited severely with exciesed and homogenized nodules by physical impact. The relative activities of early nodules grown in pH 5.5, 6.5 and 8.0 were89, 100 and 40％, and those grwon in NO??-N 1 and 3mM and NH? 1 and3mM were 6, 1 and 68, 50％, respectively. Watering levels of 20, 50 and100mL during the seedling growth resulted in 31, 120 and 8㎎ of nodule formation and 33.6, 58.4 and 8.4μM C?H?/gfw nodule/hr of the nitrogenase activity, respectively. Nodules showed a complete disappearance of nitrogenase activity at incipient wilting point though plant water content and transpiration rate were restricted to 90％ and 53％, respectively. In the third subject attempted plant ecologicalapproach, horizontal distribution of 6 species of Elaeagnus were mapped out, which were estimated as the euryecious plants by means of analysisof habitats and soil physico-chemical characters. Roots nodules were produced from April to September phenologically and distributed at 0-100㎝ deep in sand dune, 0-30㎝ deep in mountain foot and 0-20㎝ deep in limestone soil. Positive correlations are shown between dry matter ofroots and of nodules or between diameters of root and of nodule. Noduleformation on the foot were classified as 6 types. Amounts of seed production was as large as 3,300 seeds m?? yr??, but germination percent as low 52％. Under the population of E. umbellata genet was notobserved but many ramets were produced, which longevivity of the stem wasabout 20 years. Amounts of nitorgen releasing from the rhizosphere were1,574㎎ NH??/g resin and 371㎎ No??/g resin on August and September.Growth of the sapling was better under both nitrogen deficiency and Frankia inoculation than under nitrogen supply and Frankia inoculation and was vigorus on soil of a quarry and spoiled mine.

목차 Contents

• 제 1 장 서 론...12
• 제 1 절 연구배경...12
• 제 2 절 연구목적...15
• 제 2 장 연 구 방 법...16
• 제 1 절 분자생물학적 접근...16
• 1. 실험재료...16
• 2. 내생균주의 분리 및 배양...16
• 3. 뿌리혹 형성 유도...16
• 4. 뿌리혹 및 분리균주의 형태 관찰...16
• 5. DNA분리...17
• 6. 탐침 DNA표지...17
• 7. 게놈 혼성화 반응...17
• 8. 게놈 libray 작성...17
• 9. 게놈 libray로부터 nif클론 선별...18
• 10. nif유전자의 subcloing...18
• 11. 염기서열 결정 및 분석...18
• 제 2 절 식물생리학적 접근...18
• 1. 보리수나무의 채집지...18
• 2. 환경요인의 처리와분석...19
• 3.질소고정활성의 측정...20
• 제 3 절 식물생태학적 접근...20
• 1. 조사지 개황...20
• 가. 산지...20
• 나. 해안사구...21
• 다. 석회암지대...21
• 2. 보리수나무속 식물의 분포지 조사...21
• 3. 토양특성 조사...22
• 4. 생육특성과 개체군 동태...22
• 5. 근계로부터 배출하는 질소의 정량...22
• 6. 질소처리와 Frankia접종에 따큰 유식물의 생장...23
• 제 3 장 결 과...24
• 제 1 절 분자생물학적 접근...24
• 1. 공생균주의 분리...24
• 2. nif유전자클로링...24
• 3. nif유전자 염기서열 결정...25
• 제 2 절 식물생리학적 접근...25
• 1. 질소고정활성의 계절적 변화...25
• 2. 유묘의 생물량과 질소고정활성의 변화...25
• 3. 식물체의 생육특성...26
• 4. 광도...26
• 5. 온도...27
• 6. 산소...27
• 7. pH와 질소원...28
• 8. 수분 스트레스...28
• 제 3 절 식물생태학적 접근...29
• 1 보리수나무속 식물의 수평분포와 생육지 특성...29
• 2. 생육과 근류형성의 특성...30
• 3. 개체군의 유지...30
• 4. 근계의 질소배출량...31
• 5. 질소처리와 Frankia접종에 따른 유식물의 생장...32
• 6. 훼손된 생태계에 이식한 유식물의 생장...32
• 제 4 장 고 찰...33
• 제 1 절 분자생물학적 접근...33
• 제 2 절 식물생리학적 접근...34
• 제 3 절 식물생태학적 접근...35
• 제 5 장 결 론...38
• 제 1 절 분자생물학적 접근...38
• 제 2 절 식물생리학적 접근...38
• 제 3 절 식물생태학적 접근...40
• 제 6 장 참 고 문 헌...41
• 제 1 절 분자생물학적 접근...41
• 제 2 절 식물생리학적 접근...45
• 제 3 절 식물생태학적 접근...48
• 제1 세부목차...53
• 제 1 장 서론...55
• 제 2 장 연구방법...60
• 제 1 절 생물재료 및 시약...60
• 제 2 절 내생균주의 분리 및 배양...60
• 제 3 절 뿌리혹 형성 유도...61
• 제 4 절 뿌리혹 및 분리균주의 형태 관찰...61
• 제 5 절 탐침 DNA 분리 및 표지...62
• 제 6 절 Frankia로부터 게놈 DNA 분리...62
• 제 7 절 Frankia게놈 DNA의 제한효소 절단 및 Southern혼성화 반응...63
• 제 8 절 게놈 DNA의 부분절단 및 size fractiouation...63
• 제 9 절 Ligation 및 in vitro packaging...64
• 제 10 절 게놈 library로부터 nif-유전자가 삽입된 콜로니의 선별...64
• 제 11 절 nif-유전자의 subcloning...65
• 제 12 절 재조합 플라스미드의 deletion...66
• 제 13 절 염기서열 결정 및 분석...66
• 제 3 장 결 과...68
• 제 1 절 보리수나무 뿌리혹으로부터 공생균주의 분리...68
• 1. 뿌리혹 형태...68
• 2. 내생균주의 분리...68
• 3. 분리균주의 형태...71
• 4. 뿌리흑의 형성유도...71
• 제 2 절 분리균주로부터 게놈 DNA 분리 및 게놈 library 작성...76
• 1. 게놈 DNA 분리 및 게놈 혼성화...76
• 2. 게놈 library 작성...78
• 제 3 절 게놈 library로부터 nif클론 선별 및 subcloning...81
• 1. 게놈 library로부터 nif 클론 선별...81
• 2. 혼성화 절편의 subcloning...83
• 제 4 절 염기서열 결정 및 분석...83
• 1. 재조합 플라스미드의 deletion...83
• 2. 염기서열 및 아미노산 서열 분석...84
• 가. nifH의 염기서열과 아미노산 서열 분석...84
• 나. nifD의 염기서열 및 아미노산 서열 분석...93
• 제 4 장 고 찰...95
• 제 5 장 결 론...100
• 제 6 장 참고문헌...101
• 제2 세부목차...113
• 제 1 장 서 론...114
• 제 2 장 연 구 방 법...117
• 제 1 절 보리수나무의 채집지...117
• 제 2 절 식물체 및 토양의 성분분석...117
• 제 3 절 식물과 환경요인의 처리 및 분석...119
• 제 4 절 질소고정활성의 측정...120
• 제 3 장 결 과...122
• 제 1 절 질소고정활성의 계절변화...122
• 제 2 절 식물체의 생육특성...126
• 제 3 절 유묘의 생체량과 질소고정활성의 변화...126
• 제 4 절 광 도...129
• 제 5 절 온 도...130
• 제 6 절 산 소...130
• 제 7 절 pH와 질소원...134
• 제 8 절 수분스트레스...136
• 제 4 장 고 찰...140
• 제 5 장 결 론...143
• 제 6 장 참 고 문 헌...145
• 제3 세부목차...152
• 제 1 장 서 론...155
• 제 2 장 연 구 방 법...157
• 제 1 절 조사지 개황...157
• 1. 산지...157
• 2. 해안사구...157
• 3. 석회암지대...160
• 제 2 절 연구방법...161
• 1. 보리수나무속 식물의 분포지 보사...161
• 2. 토양환경요인측정...161
• 가. 토양, 뿌리 및 근류의 채취...161
• 나. 토양 특성 조사...163
• 3. 생육특성 밋 개체군 동태...165
• 가. 보리수나무의 생육특성...165
• 나. 종자 생산량...165
• 다. 종자 발아...165
• 라. 개체군의 연령과 연륜생장...166
• 마. 지하포복근에서의 무성번식 개체 조사...166
• 4. 근계로 부터 배출하는 질소의 정량...166
• 가. 이온교환수지 주머니 준비...166
• 나. 이온교환주머니의 매립과수거...167
• 다. 질소의 추출과 정량...167
• 5. 질소처리와 Frankia 접종에 따른 유식물의 생장...168
• 가. 질소처리와 Frankia접종...168
• 나. 생장해석...169
• 6. 폐광산지와 대기오염 지역의 생육조사 및 SO2 폭로실험...169
• 가. 생육조사...169
• 나. SO$_2$ 폭로실험...169
• 7. 통계분석...170
• 제 3 장 결 과...171
• 제 1 절 보리수나무속 식물의 분포...171
• 1. 보리수나무...171
• 2. 보리밥나무...171
• 3. 보리장나무...173
• 4. 큰보리장나무...173
• 5. 녹보리똥나무...174
• 7. 왕볼레나무...174
• 제 2 절 생육지의 특성...175
• 제 3 절 생육과 근류형성의 특성...179
• 1. 식물계절...179
• 2. 뿌리와근류의 수직분포...179
• 3. 뿌리무게와 근류무게 사이의 상관...182
• 4.굵은부리 직경과 근류직경 사이의 상관...182
• 5. 근류의 형성유형 및 감염부위...182
• 제 4 절 개체군의 정착...187
• 1. 종자생산과 발아율...187
• 2. 라메트에 의한 개체군 유지...187
• 제 5 절 근계의 유효질소 배출량...199
• 제 6 절 질소처리와 Frankia 접종에 따른 유식물의 생장...201
• 1. 줄기길이, 식물량 및 엽면적의 생장...201
• 2. 생장해석...203
• 3. 건중량분배...207
• 4. 근류의 빈도와 평균 근류수...207
• 제 7 절 훼손된 생태계에 이식한 유식물의 생장...209
• 1. 채석장, 페광산 및 대기 오염지역...209
• 2. 이산화황에 대한 내성...209
• 제 4 장 고 찰...214
• 제 1 절 보리수나무속 식물의 분포와 토양특성...214
• 제 2 절 보리수나무 개체군 동태...218
• 제 3 절 근계에서 배출하는 질소량...220
• 제 4 절 질소처리와 Frankia 접종에 의한 생장비교...221
• 제 5 절 훼손된 생태계에 이식된 보리수나무의 생육과 이용효율...222
• 제 5 장 결 론...224
• 제 6 장 참고문헌...225