초록 ▼

Acetolactate synthase (ALS)는 고등식물과 미생물에서 필수아미노산 Val, Leu, Ile 생합성에 공통적으로 관여하는 효소이며 이들 아미노산의 생합성을 조절하는 중요한 단계이다. ALS는 최근에 개발된 sulfonylureas (SU), imidazolinones (IM), triazolopyrimidines (TP)등 여러종류의 제초제의 공통적 작용표적이 된다. 본 과제에서는, ALS을 표적으로 하는 새로운 제초제 개발과 제초제에 내성을 갖는 ALS 유전자 설계를 위해, ALS에 대한 효소학적 및 유전공학

Acetolactate synthase (ALS)는 고등식물과 미생물에서 필수아미노산 Val, Leu, Ile 생합성에 공통적으로 관여하는 효소이며 이들 아미노산의 생합성을 조절하는 중요한 단계이다. ALS는 최근에 개발된 sulfonylureas (SU), imidazolinones (IM), triazolopyrimidines (TP)등 여러종류의 제초제의 공통적 작용표적이 된다. 본 과제에서는, ALS을 표적으로 하는 새로운 제초제 개발과 제초제에 내성을 갖는 ALS 유전자 설계를 위해, ALS에 대한 효소학적 및 유전공학적 연구를 수행하였으며 그리고 새로운 제초제 후보화합물을 합성하여 ALS에 대한 저해활성을 측정하였다. 제1세부과제에서는 보리조직으로 부터, ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sephacel, hydroxylapatite, Sephadex G-150-120, 그리고 Mono-Q 크로마토그라피를 거쳐 약 330배 정제된 순수한 ALS을 최초로 얻었다. Gel electrophresis 방법으로 측정한 native ALS와 ALS subunit의 분자량은 각각 약 234 KDa와 약 64 KDa였다. 제초제 후보화합물로 합성한 triazolopyrimidine, pyrimidyl-oxy(thio)-benznene (POB), 그리고 4,6-dimethoxypyrimidine (DP) 유도체들은 식물 ALS에 저해활성을 나타낸 반면, POB 계열은 비교적 낮은 활성을 보였다. 세 계열의 저해제 모두 mixed-type의 저해유형을 보였으며, TP와 DP 계열의 저해제는 incubation 시간에 따라 저해활성이 증가한 반면, POB 계열은 일정한 저해활성을 유지하였다. 이중저해 실험결과 SM, DP, POB, 그리고 Leu은 ALS에 상호 경쟁적으로 결합하며, 화학적 변형 결과는 SM, DP 결합에 Trp 잔기가 관여할 가능성을 시사하였다. 제2세부과제에서는 식물 ALS 유전자를 박테리아에서 발현시켜 식물 ALS을 대량으로 생산하고, 또한 제초제에 내성을 갖는 ALS 유전자 개발에 그 목적을 두고 있다. 본과제에서는 아직 클로닝된 적이 없는 완두 ALS 유전자를 Arabidopsis ALS 유전자를 probe로 하여 클로닝 하였으며 현재까지 828개의 DNA 염기서열을 결정하였다. Sulfonylurea에 내성을 갖는 담배 ALS 유전자를 E. coli에서 발현시켜 ALS 활성을 확인하였으며, 그리고 발현 ALS는 DP계열 K11570에 대해서도 내성을 갖고 있음을 밝혔다. 또한 발현벡타 pTATA에 클로닝된 Arabiodopsis ALS 유전자를 E. coli에서 발현시킨 후 ALS의 활성을 확인하였으며, 그리고 DP계열 K11570에 대한 작용을 조사한 결과 I?? 값이 0.6±0.1nM로, K11570이 강력한 제초효과를 가지고 있음을 밝혔다. 제3세부과제에서는 효모로 부터 ALS을 부분 정제하여 효소의 안전성, 일반적인 성질, 최종산물 Val, Leu, Ile에 의한 feedback 저해를 조사하였다. Feedback 저해에서는 Val에 의해 가장 많은 영향을 받았으며, Leu에 의해서는 거의 영향을 받지 않았다. Arabidopsis ALS 유전자를 E. coli에서 발현시켜, DEAE-cellulose, phenyl sepharose, hydroxylapatite, Mono-Q 크로마토 그라피 단계를 거쳐 107배 정도 정제하였다. Subunit의 분자량은 약 65KDa였으며 Km은 5.9mM이였다. 클론된 효소는 최종산물 Val, Leu, Ile에 의해 저해를 받지 않는 특이성을 나타내었다. 제4세부과제에서는 새로운 제초제 후보물질로 pyrimidyl-oxy(thio)-benzene 계열과 triazolopyrimidine 유도체들은 합성하였다. 합성한 제초제 후보 화합물에 대해서는 식물 ALS을 이용하여 제초제로 개발 가능성이 있는 몇가지 화합물을 선별하였다. 또한 500㎒ NMR을 이용하여 ALS 반응메카니즘을 연구하기 위해 탄소-13 동위원소를 함유한 thiamine (보조효소 전구체)를 합성하였다. 본 연구의 중요 결과를 요약하면, 최초로 식물에서 ALS의 순수정제, 식물 ALS의 E. coli에서 발현 및 정제, 그리고 개발 가능성이 있는 제초제 후보물질의 합성과 선별이다. 따라서 본 연구는 ALS을 표적으로 하는 제초제 개발과 제초제에 내성을 갖는 작물 개발을 위해 상당한 수준의 기반을 조성하였다고 판단된다.

Abstract ▼

In higher plants and microorgainsms acetolactate synthase (ALS) catalyzes the common step in the biosynthetic pathways of essential amino acids, Val, Leu, Ile and the enzyme is one of control steps in the pathways. ALS is the target site of recently developed several classes of herbricides includin

In higher plants and microorgainsms acetolactate synthase (ALS) catalyzes the common step in the biosynthetic pathways of essential amino acids, Val, Leu, Ile and the enzyme is one of control steps in the pathways. ALS is the target site of recently developed several classes of herbricides including the sulfonylureas (SU), the imidazolinones (IM), and triazolopyrimidines (TP). The major objective of this project is to develope new ALS inhibiting herbicides and design herbicide-resistant ALS gene. For this goal we have carried out enzymiatic and venetic engineering studies of ALS, and also synthesized herbicide candidate compounds and determined their inhibitory activities on plant ALS. In the first part of this project, we have firstly purified ALS from etiolated barley shoots to homogeneity using ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sephacel, hydroxylapatite, Sephadex G-150-120, and Mono-Q chromatography. A 330-fold purification was achieved. The molecular weights of native ALS and subuint of ALS as determined by gel eletrophoresis were about 234KDa and 64KDa, respectively. We have determined the inhibitory activities and modes of inhibition of triazolopyrimidine, pyrimidyl-oxy(thio)-benzene (POB), and 4,6-dimethoxy pyrimidine (DP) derivatives which were newly synthesized as ALS inhibitors. DP derivatives showed higher inhibitory activity, while POB derivatives were relatively low in ALS inhibiting activities. Three classes of inhibition of plant ALS by TP and DP inhibitors on incubation time. Dual with each other in their binding to ALS. Chemical modification studies suggested the involvement of Trp residue in the binding of SU and DP to ALS. The second part of this project aimed at mass production of plant ALS by expression of plant ALS gene in E. coli, and designing herbicide resistant ALS gene. Pea ALS gene was firstly cloned using Arabidopsis ALS gene as probe, and so far 828 DNA bases have been sequenced. Tobaco ALS mutant gene, which is resistant to sufonylurea, was expressed in E. coli, and ALS activity was confirmed. The expressed ALS enzyme was confirmed to be resistant to DP inhibitor K11570. A plasmid pTATX containing the wild-type Arabidopsis ALS coding sequences was also expressed in E. coli MF2000, and the expressed ALS was very sensitive to DP inhibitor K11570 . In the third part of this project, ALS has been partially purified from the supernatant fraction of yeast. The stability, enzymatic properties, and feedback inhibition of yeast ALS were investigated. The study of feedback inhibition showed that Val is a strong inhibitor while Leu is a weak inhibitor. Arabidopsis ALS gene has been expressed in E. coli and ALS has been purified by DEAE-cellulose, Phenyl Sepharose, hydroxylapatite and Mono-Q chromatography. Molecular weight of subunit was estimated to be about of 65KDa and purification fold was 107 times. The cloned enzyme showed Km value of 5.9mM, and was not inhibited by end products, Val, Leu, and Ile. In the fourth part, pyrimidyl-oxy(thio)-benzene and triazolopyrimidine derivatives as ALS inhibitors were synthesized, and their inhibitory activities on plant ALS were determined. To study reaction mechanism of ALS using 500㎒ NMR, a thiamine (precursor of ALS coenzyme) containing ??C isotope was synthesized. The major achievements of this project are the first purification of ALS, and the synthases and screening of potential herbicide candidates. Thus, it is considered that these studies contribute significantly to development of new ALS inhibiting herbicides and to design of herbicide-resistant ALS gene.

목차 Contents

• I. 본 문...8
• 1. 서 론...8
• 2. 연구방법...10
• 3. 결 과...15
• 4. 고 찰...20
• 5. 결 론...23
• 6. 참고문헌...25
• II. 논문목록서...26
• III. 총평...33
• 제 1 세 부 목 차...38
• I. 본문...40
• 1. Barley Acetolactate Synthase의 정제와 저해에 관한 연구...40
• 2. Inhibition of Acetolactate Synthase by Pyrimidyl-oxy-benzoate and Pyrimidyl-thio-benzenes...40
• 3. Inhibition of Acetolactate Synthase by Pyrimidine Derivatives...40
• 4. The Interaction of Barley Acetolactate Synthase with Dimethoxy-pyrimidine Inhibitors...40