효모에는 메르캅탄(mercaptan)으로 구성된 금속촉매산화계에 의한 효소의 불활성화를 억제하지만 메르캅탄을 아스코르브산 등의 다른 전자공여체로 대치하면 더 이상 억제하지 못하는 분자량 25,000의 티올특이성 항산화단백을 보고한 바 있다. 이 효모 항산화단백에 대한 항체를 이용하여 조사하였을 때 포유종물의 뇌 조직에 특이 높은 수준으로 분포하였으며 알려진 항산화 효소 활성도를 나타내지 않았다. 이러한 항산화단백에 대한 본 연구의 결과는 다음과 같다. 효모 항산화단백은 mercaptan을 함유하는 금속촉매산화계에 의한 효소의
효모에는 메르캅탄(mercaptan)으로 구성된 금속촉매산화계에 의한 효소의 불활성화를 억제하지만 메르캅탄을 아스코르브산 등의 다른 전자공여체로 대치하면 더 이상 억제하지 못하는 분자량 25,000의 티올특이성 항산화단백을 보고한 바 있다. 이 효모 항산화단백에 대한 항체를 이용하여 조사하였을 때 포유종물의 뇌 조직에 특이 높은 수준으로 분포하였으며 알려진 항산화 효소 활성도를 나타내지 않았다. 이러한 항산화단백에 대한 본 연구의 결과는 다음과 같다. 효모 항산화단백은 mercaptan을 함유하는 금속촉매산화계에 의한 효소의 불활성화를 막을 뿐만아니라 효소 단백질의 분절, 단백질 중의 carbonyl기의 도입, 핵산의 분절 및 염기변형 등 또한 억제하였다. 항산화단백은 메르캅탄이 존재시 과산화수소를 분해하는 활성이 있었다. 따라서 메르캅탄은 항산화단백의 활성에 전자공여체로서 요구되는 것으로 보인다. 효모로 부터 정제한 티오레독신(thioredoxin)과 티오레독신환원효소(thioredoxin reductase) 두 단백질과 함께 NADPH가 있으면 항산화단백은 아스코르산(ascorbate)으로 구성된 금속촉매산화계에 의한 효소의 불활성화를 억제하였을 뿐만 아니라 항산화활성이 10배 증가하였다. 또한 이러한 조건에서 효모 항산화단백의 과산화수소 제거활성이 관찰되었다. 이러한 티오레독신계는 생리적인 전자공여체로서 항산화단백의 디설피드(disulfide)를 환원시켜 촉매작용을 가능하게 하는 것으로 보인다. 사람 적혈구로 부터 항산화단백을 정제하였는 바, 이 단백질은 적혈구 내의 주된 단백질 중의 하나였으며 효모 항산화단백과 마찬가지로 메르캅탄이나 티오레독신계를 함유하는 금속촉매산화만을 선택적으로 억제하였다. 사람 적혈구 항산화단백은 금속촉매산화계에 의한 헤모글로빈의 산화, 핵산의 산화적 분절 손상 및 적혈구 막지질의 과산화를 억제하였다. 사람 뇌조직의 항산화단백 cDNA 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 규명하였다. 분자량 21,729의 197 아미노산잔기의 단백질을 저장하고 있었으며 이의 발현산물 단백질은 항산화활성을 나타냈다. 뇌조직에 허혈/재관류 조작에 의하여 손상을 주었을 때, 핵산의 산화적 손상이 증가되었다. (catalase)는 감소되었다. 따라서 허혈/재관류에 의한 핵산의 산화는 항산화효소계의 변화보다는 활성산소중의 증가에 기인하는 것으로 보인다. 효모 항산화단백의 아르기닌, 히스티딘 및 리신 잔기를 변형시키는 화학물질로 처리시에는 항산화활성의 변화가 거의 없었다. 반면에 시스테인이나 트리프토판 잔기를 변형시키는 시약에 의하여 항산화활성이 소실되었다. 항산화단백들과 상동성을 보이는 47의 시스테인잔기와 82번 및 172번의 트리프토판 잔기를 유전공학적 방법으로 각각 알라닌과 페닐알라닌으로 치환하고 발현시켜 정제한 활성을 조사하였을 때 47 시스테인 잔기를 변형시킨 변이 항산화단백은 완전히 활성이 나타나지 않았으며, 82번과 172번의 트리프토판 잔기를 변이시킨 것은 각각 원래 항산화단백활성의 80％와 20％ 수준의 활성을 나타냈다. 효모 항산화단백을 발현시켜 대장균은 과산화수소를 배지에 가할 경우 항산화단백 유전자가 없는 대장균에 비하여 성장률이 유의성 있게 높았다. 47번 시스테인과 82번 트리프토판잔기를 치환시킨 변이 유전자를 도입시킨 대장균의 생장률은 각각 항산화단백 유전자를 가지고 있지 않는 대장균과 변이시키지 않은 항산화단백 유전자를 가지고 있는 대장균과 거의 유사하였다. 효모 항산화단백은 시험관과 생체내 조건 모두 크산틴탈수소효소 (xanthine dehydrogenase)가 활성산소종을 발생하는 xanthine oxidase로의 전환에는 영향이 없었다.
Abstract▼
We had shown that yeast contains a 25-kDa protein (TSA, thiol specific antioxidant protein) which provides several enzymes with protection against the MCO system containing a mercaptan, but not against the MCO system containing the nonsulfhydryl reducing equivalent. Immunoblotting experiments revea
We had shown that yeast contains a 25-kDa protein (TSA, thiol specific antioxidant protein) which provides several enzymes with protection against the MCO system containing a mercaptan, but not against the MCO system containing the nonsulfhydryl reducing equivalent. Immunoblotting experiments reveal that rat tissues, especially brains, also contain a 25-kDa protein which can be specifically recognized by antibodies derived against the yeast protein. The yeast protein does not possess catalase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase, or iron chelation activites. In this study we attempted to clarify the role of the TSA protein in vivo and in vitro. The results are as follows : The TSA from s. cerevisiae specifically prevents not only the inactivation of enzymes also the fragmentation of protein, incorporation of carbonyl groups into protein, strand breaks in pBluscript plasmid DNA, and the formation of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OH-dG) in calf thymus DNA when induced by the thiol/Fe??/O? MCO system. Ascorbate/Fe??/O? MCO system mediated damage of enzymes could be prevented by the antioxidant protein only in the presence of reduced thiol. The yeast protein found to remove hydrogen peroxide in the presence of dithiothreitol. It seems that the antioxidant activity of the TSA protein against a MCO system requires thiol as a reducing equivalent to restore its catalytic activity. Two proteins from the yeast, thioredoxin and thioredoxin reductase, when presented with NADPH and the yeast antioxidant protein prevented the inactivation of glutamine synthetase and damage of DNA by the ascorbate/Fe??/O? MCO system. This system also removes hydrogen peroxide effectively. Those results suggested that NADPH-dependent thioredoxin system is a physiological electron donor for TSA and reactivated the antioxidant protein by reversible disulfide-thiol exchange. A TSA was purified from human red blood cells. The TSA exists as a predominat protein in human erythrocytes, which showed distict TSA activites in the presence of dithiothritol or thioredoxin system as a reducing equivalent. The human TSA completely inhibited visible absorption spectral change of oxyhemoglobin, DNA cleavege, and the preoxidation of RBC membrane by a nonezymatic thiol/Fe??/O? MCO system. The complete cDNA encoding thiol specific antioxidant protein was isolated from a human brain cDNA library. An open reading frame was identified and found to encode a polypeptide of 197 amino acids with a Mr of 21,729. Expressin of the human antioxidant cDNA in E. coli yielded a functionally active protein. Oxidative DNA damage, as measured by the 8-OH-dG level, was increased in global brain by ischemia/reperfusion insult. Ischemia/reperfusion insult to gerbil brain did not cause any significant induction of antioxidant enzymes, such as superoxide dismutase, catalase, or TSA. However, catalase activity was slightly decreased. These results suggest that ischemia/reprfusion insult to gerbil brain cause the DNA damage via the production of reactive oxygen species and that the antioxidant enzyme systems were not induced to prevent oxidative damage to DNA. Any loss of antioxidant activity was not found chemical modification of amino acid residues such as arginine, histidine and lysine of the yeast TSA. N-ethylaleimde in the presence of thiols or N-bromosuccimide completely inhibited TSA activity. Cys47, Trp82, and Trp172 conserved highly in a family of proteins that exhibit sequence identity of 20％ to 95％ with TSA were replaced by Ala and Phe and expressed the mutant TSA proteins (C47A, W82F, and W172F). C47S was completely inactive. W82F and W172F showed partial activity as 80％ and 20％ of the activity of wild type TSA. The growth rate of E. coli strain expressed with wild type yeast TSA was significantly higher than that of E. coli in the presence of hydrogen peroxide. The growth rates of E. coli containing C47A and W82F TSA gene was similar to those of E. coli without TSA gene and E. coli containing wild type TSA gene. The eggect of yeast TSA on the conversion of xanthine dehydrogenase form to xanthne oxidase form was not observed in vitro and in vivo.
목차 Contents
제 1 장 서론...13
제 1 절 연구배경...13
제 2 절 연구 범위 및 목적...14
제 2 장 재료 및 방법...17
제 1 절 제 1세부과제...17
1. S.cerevisiae 항산화단백질의 정제...17
2. 항산화단백의 항산화활성도 조사...17
3. 효모 항산화단백의 disulfide 양상 조사...17
4. 항산화단백에 대한 생리적 전자공여체에 관한 연구...18
5. 항산화단백의 화학적 변형이 항산화활성에 미치는 효과...18
6. 유전공학기술에 의한 효모 항산화단백의 아미노산 잔기의 치환...18
제 2 절 제 2세부과제...18
1. 사람 뇌조직의 cDNA 유전자은행제조 및 항산화단백 유전자 클로닝...18
2. 사람뇌조직 항산화단백 유전자 발현...19
3. 사람 뇌조직 항산화단백의 Chain-breaking 활성 및 과산화수소 제거활성 조사...19
4. 사람혈액에 존재하는 혈구세포 및 Plasma 내의 항산화단백 조사, 정제 및 특성연구...19
제 3 절 제 3 세부과제...19
1. 지질, DNA 손상에 대한 항산화단백의 보호효과...19
2. 기존에 알려진 항산화효소와의 유사 활성도 조사...20
3. 지질과산화물에 의한 superoxide dismutase의 활성저해와 이에 대한 항산화단백의 효과...20
4. Thiyl 라디칼 발생계에 대한 항산화 단백의 작용...20
5. E. coli oxyR mutants 및 항산화단백 유전자를 가진 E. coli와 wild type간의 비교...21
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