초록 ▼

가름류의 경우, 초기 배아의 발생학적, 형태학적 특이성 때문에 닭의 germline내에 recombinant DNA를 주입하여 형질 전환 닭을 생산하는 기술은 포유 동물의 수정란에 외래 유전자를 주입하는데 사용되는 기술로는 접근하기가 어렵다. 즉 가금류의 난자는 크고 깨지기 쉽고, 수정시에 여러개의 정자가 한꺼번에 수정되어 여러개의 전핵이 존재하여, 수정란을 체외에서 다루기가 힘들고, 수정란에서 전핵을 인지하는 것이 매우 어렵다. 또한 배란 후 대략 30분이 경과하면 수정이 일어나 산란 20분전까지 난관내에서 세포분열이 왕성하게 일

가름류의 경우, 초기 배아의 발생학적, 형태학적 특이성 때문에 닭의 germline내에 recombinant DNA를 주입하여 형질 전환 닭을 생산하는 기술은 포유 동물의 수정란에 외래 유전자를 주입하는데 사용되는 기술로는 접근하기가 어렵다. 즉 가금류의 난자는 크고 깨지기 쉽고, 수정시에 여러개의 정자가 한꺼번에 수정되어 여러개의 전핵이 존재하여, 수정란을 체외에서 다루기가 힘들고, 수정란에서 전핵을 인지하는 것이 매우 어렵다. 또한 배란 후 대략 30분이 경과하면 수정이 일어나 산란 20분전까지 난관내에서 세포분열이 왕성하게 일어나게 되어, 세포수는 대략 60000개로 pluripotent 한 특성을 가지게 된다. (Eyal-Giladi, 1981). 이러한 것들을 극복하여 형질전환 닭을 생산하는데 시도되고 있는 방법으로는 원시성세포(primordial Germ Cell)를 운반체로 이용하는 방법이 있다. 본 연구에서는 LacZ, neo 유전자를 각각 갖는 plasmid DNA를 chicken embryo fibroblast에 여러 가지의 transfection 방법에 따라 transfection 시켜, 그 효율을 측정하였고, 세포내에서 안정되게 발현함을 관찰하였다. 또한 배발달중(stage 6-8)인 배아의 germinal crescent로 부터 원시성세포를 분리하여 plasmid DNA를 transfection 시켜 배자에 미세주입하였다. 그 결과 성세포의 전구체인 원시성세포가 유전적으로 조작가능하였고, 조작된 원시성세포를 발달 단계의 배자에 이식함으로써 transfection된 원시성세포가 배자의 원시정소로 이동하여, 정상적인 발달과정을 거쳐 발생 3일령의 병아리 정소에서 Lac Z 유전자를 포함한 PGC가 성공적으로 발현하였다. 따라서 plasmid DNA를 사용하여 체외에서 성세포의 유전적 조작이 가능하며 성세포 조작에 의한 형질전환 가금의 생산이 가능하리라 사료된다.

Abstract ▼

In avian species, the morphological and developmental characteristics of the early embryo restrict the use of microinjection method for gene transfer in aves. Therefore, introduction of recombinant DNA into the germline was attempted by using retrovirus vectors. However, the use of vectors developed

In avian species, the morphological and developmental characteristics of the early embryo restrict the use of microinjection method for gene transfer in aves. Therefore, introduction of recombinant DNA into the germline was attempted by using retrovirus vectors. However, the use of vectors developed from pathogenic retroviruses for the production of commercial chickens have been questioned for its safety. Thus, the objectives of this study are to examine the expression of the transfected marker plasmid from in vitro chicken cell culture, and to analyse the DNA integration mechanism of plasmid DNA into the host chromosome. In addition, the objective of genetic modification is to ultimately control the genetic material of the germline. For introduction of novel genes into the germline, utilizing the manipulated primordial germ cell as the progenitors of the germline is the best tool for direct gene transfer into the germline. The purpose of this study is to develop the model system to establish the experimental conditions for integrating genetic material into the chicken genome. To develop the method of gene trasfer, chicken PGCs were used as a vector. The objectives of this study are to determine whether the plasmid DNA is stably integrated or not, and whether the PGC is genetically modified in vitro. We determined the transfection efficiency at which the chicken embryonic fibroblasts were transfected with plasmid DNA containing Lac Z or neo gene, and observed the stable expression of these genes in embryonic fibroblast. The expression of plasmid DNA observed in the PGCs which had been isolated form the germinal cresent of stage 6-8 embryo and the transfected PGCs were microinjected into the recipient embryo of stage 6-8. The result shows that the microinjected PGCs migrated into the future gonad and colonized on it and expressed the Lac Z in the gonad of 2-3 day old chicken. Therefore, it is possible to genetically manipulate the chicken PGCs with plasmid DNA, and to produce the transgenic chicken by in vitro PGC manipulation.

목차 Contents

• 가. 연구 과제명...11
• 나. 연구 목적, 내용 및 방법...11
• 연구 목적...11
• 연구 내용...11
• 연구 방법...13
• (1) Vector structure...13
• (2) Plasmid DNA 분리...13
• (3) 닭 세포 준비...13
• (4) Transfection 방법...13
• Calcium phosphate에 의한 transfection...13
• Liposome에 의한 transfection...14
• DEAE-dextran에 의한 transfection...14
• (5) Transfection된 세포의 선발방법...14
• $\beta$-galactosidase 활성 측정...14
• Neo 유전자 발현 분석...14
• T-ag 유전자의 발현 분석...14
• (6) 원시성세포(primordial germ cell)분리...15
• (7) 원시성세포의 주입방법...15
• 다. 연구 계획 대 진도...16
• 라. 주요 연구내용 및 최종결과...17
• (1) 공시축 사양준비 및 시험...17
• (2) 세포 배양...17
• (3) Plasmid structure...18
• (4) Plasmid preparation 및 DNA 측정...19
• (5) Transfection...19
• Calcium phosphate에 의한 transfection...19
• Liposome에 의한 transfection...20
• DEAE-dextran에 의한 transfection...21
• (6) Histochemical staining for $\beta$-galactosidase activity...21
• (7) G418 첨가 실험...23
• (8) Neo gene selection...23
• (9) T-ag 유저자 발현...24
• (10) Chicken embryo 분리...25
• (11) Germinal crescent로 부터 원시성세포(Primordial Germ Cell) 분리...25
• (12) PAS 염색...26
• (13) 원시성세포내 Plasmid DNA 주입...27
• (14) Microinjection of trasfected PGC into the developing embryos...27
• (15) Gonad 채취...30
• (16) Gonad screening...31
• (17) Transgenic chicken생산 검정...32
• 인용 문헌...33
• 논문 발표실적 또는 계획...34
• 학위배출실적...34
• 연구비 항목별 집행내역...35