한국과학기술원 Korea Advanced Institute of Science and Technology
등록번호
TRKO200200016917
DB 구축일자
2013-04-18
초록▼
거머리에는 매우 다양한 단백질 분해효소 억제제가 존재한다고 알려져 있고 현재 많은 연구가 이와 관련되어 전세계적으로 행해지고 있다. 가장 두드러진 세가지 단백질 분해효소 억제제들을 예로 들면, hirudin, bdellin, 그리고 eglin이 그 억제제들이다. 이 세가지 억제제 모두 면역학적으로 명백한 차이가 있고, 의학적으로 중요한 역할을 한다. Bdellin과 eglin은 아미노산 서열이 유사하고, 다른 인체로 부터 유래한 단백질 분해효소 억제제와 구조적으로 유사성이 있는 것으로 알려져있다. 히루딘은 분리 및 구조 분석
거머리에는 매우 다양한 단백질 분해효소 억제제가 존재한다고 알려져 있고 현재 많은 연구가 이와 관련되어 전세계적으로 행해지고 있다. 가장 두드러진 세가지 단백질 분해효소 억제제들을 예로 들면, hirudin, bdellin, 그리고 eglin이 그 억제제들이다. 이 세가지 억제제 모두 면역학적으로 명백한 차이가 있고, 의학적으로 중요한 역할을 한다. Bdellin과 eglin은 아미노산 서열이 유사하고, 다른 인체로 부터 유래한 단백질 분해효소 억제제와 구조적으로 유사성이 있는 것으로 알려져있다. 히루딘은 분리 및 구조 분석과 트롬빈과의 상호작용을 알아내기 위해 많은 노력이 이루어져 왔으며 현재도 연구가 계속 진행되고 있다. 히루딘은 작은 분자량을 갖는 폴리펩티드로 트롬빈에 특이적으로 결합하는 억제제이다. 자연상태의 히루딘은 글루타민과 아스파라진이 많이 함유되어있고, 열에 대한 저항성은 수소이온농도가 낮을수록 크며, 플라스민, 트립신, 키모트립신 같은 단백질 분해효소에 저항성이 높다. 히루딘의 응용범위는 다양한데, 프로트롬빈의 혈중량을 측정하여 dicomarol 변이체에 의한 혈액내 프로트롬빈양의 변화를 알 수 있고, 혈액에 관련된 질병에 많이 사용되는 다당류인 헤파린에 비해 장점이 많기 때문에 의학적으로 이용될 가치가 높다. 또한 히루딘은 트롬빈 특이적 억제제이기 때문에 섬유육종세포에 대한 트롬빈의 성장 촉진 활성을 관찰하는데 사용되고 있다. 본 연구에서는 흡혈 거머리의 침샘에 존재하는 단백질을 분석하여 혈액응고에 관련이 있는 성분을 알아내고 그 성분에 대한 활성을 측정, 외국의 여타 알려진 성분과 비교 분석하는 것을 목적으로 한다. 거머리 용출액으로부터 스크리닝한 결과 강력한 트롬빈 억제제 활성이 나타났으며, 여러가지 단백질 순수분리 방법을 적용하여 트롬빈 억제제를 분리하였다. 생화학적인 특성 분석은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 질량 분석 스펙트럼에 의한 실제 질량 분석, 아미노산 조성의 분석, 억제 작용 기작 등을 조사하였으며, 아미노산 말단기 서열분석은 말단이 어떤 변형에 의해 서열분석이 불가능하여 여러가지 방법으로 제거를 함으로써 아미노산 서열을 알아내려고 하였다. 그 결과 분자량이 6900 정도의 폴리펩티드가 분석되었으며 활성과 특이성이 매우 높고 효소 억제 상수가 10??? 정도의 작용 활성을 나타내었다. 열과 계면 활성제에 저항성이 뛰어난 것으로 밝혀졌고 아미노산 조성이 여타 히루딘 변이체와 약간 차이가 잇는 것으로 나타났다. 본 연구의 결과로 우리나라 거머리로부터 다른 거머리에서 발견되는 단백질 분해 효소 억제제와는 달리 새로운 트롬빈 억제활성을 가진 폴리펩티드를 발견해 내었고 이러한 새로운 유용물질로부터 기초적인 생물학 분야에 사용될 억제제로 개발된 가능성이 있을 뿐만 아니라 의학 분야에 치료제로서도 응용될 가능성이 매우 높은 결과를 얻을 수 있었다.
Abstract▼
Leech has known that it contains various protease inhibitors in body, and many researchers are working protease inhibitors from this animal around the world. Three outstanding protease inhibitors are known, which are hirudin, bdelin, and eglin. These protease inhibitors have serological, medical i
Leech has known that it contains various protease inhibitors in body, and many researchers are working protease inhibitors from this animal around the world. Three outstanding protease inhibitors are known, which are hirudin, bdelin, and eglin. These protease inhibitors have serological, medical importances. Bdelin and eglin are similar with amino acid compositions and also have similarity on the structure of protease inhibitors derived from human being. Hirudin is a polypeptide inhibitor which binds to thrombin specifically. Natural hirudin has quantities of glutamine and asparagine. It is heat-stable at low pH, and resistant to proteases such as plasmin, trypsin, chymotrypsin A. Hirudin is used in various applications : (1) to investigate the blood prothrombin amount derived by dicoumarol derivations, (2) to substitute for heparin which is a polysaccharide used as therapeutic agent on blood diseases, and (3) to monitor growth activating effect of thrombin on fibroblast. In this study, we have investigated antithrombin agent from blood-sucking leech salivary gland and assayed the inhibiting activity for comparison to the other known thrombin inhibitors. Screening from leech crude extracts resulted strong thrombin inhibiting activities. Isolation and biochemical characterization were performed by the methods of polyacrylamide gel electrophoresis, mass spectrometry, amino acid comosition, sequence analysis, and thrombin inhibition kinetics. N-terminal amino acid residue was blocked by some modification and resulted no N-terminal amino acid sequence. Deblocking of N-terminus by trifluoroacetic acid gave an internal sequence. The antithrombin agent was a polypeptide which has about 6900 Da molecular weight and the amino acid composition is differenct to other thrombin inhibitors.
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