초록 ▼

유전자 치료용 retroviral vector를 효율적으로 생산하기 위해amphotropic producer 세포 (pMFG/ψ CRIP)로부터 생산되는 retroviral vector의production과 inactivation 속도에 미치는 온도와 혈청농도의 효과를 다양한 배양방법을 통해알아보았다. 1-10%의 다양한 혈청농도는 37℃에서 vector의 inactivation에 큰 영향을 주지 않았다. Vector의 half-life는 2.0-2.7시간으로 거의 일정하였다. 그러나, 혈청농도는

유전자 치료용 retroviral vector를 효율적으로 생산하기 위해amphotropic producer 세포 (pMFG/ψ CRIP)로부터 생산되는 retroviral vector의production과 inactivation 속도에 미치는 온도와 혈청농도의 효과를 다양한 배양방법을 통해알아보았다. 1-10%의 다양한 혈청농도는 37℃에서 vector의 inactivation에 큰 영향을 주지 않았다. Vector의 half-life는 2.0-2.7시간으로 거의 일정하였다. 그러나, 혈청농도는세포의 성장과 vector의 생산에는 큰 영향을 주었다. 세포가 subconfluency에 도달했을때 새로운 배지로 교환해 주는 일반적인 vector 생산방법에서는 10% 혈청농도에서 최대 세포 농도와 vector titer가 각각 2.31×105 cells/㎠, 6.2(±0.7; 표준편차)×105 colony formingunit (CFU)/㎖ 이었다. 한편, 1%에서 최대 세포 농도와 vector titer는 각각 1.12×105cells/㎠, 1.3(±0.3)×105 (CFU)/㎖ 이었다. 또한 1% 혈청농도의 경우 배지를 매일 교환하여 배양하여도 세포 성장과 vector 생산이 증가되지 않았다. 그러나 10% 혈청농도의 경우배지를 매일 교환하여 주는 경우 더 높은 세포 성장을 얻어 최대 vector titer가 1.1(±0.1)×106 (CFU)/㎖까지 도달하였다. 또한 배지를 매일 교환해 주는 경우 높은 세포 농도를 유지하면서, 16일 동안 vector를 생산하므로 각각 더 높은 titer를 가진 retroviral vector를 연속적으로 대량 생산할 수 있는 perfusion culture를 적용할 수 있을 것이다.pMFG/CRIP producer 세포로부터 얻어진 retroviral vector의 titer는 vector의 생산과inactivation 속도에 의한 dynamic interplay에 의해 결정되어진다. 두 속도 모두 온도에의해 크게 영향받았다. Retroviral vector의 생산에 있어서, 1) retroviral vector half-life는온도에 의해 크게 영향받았으며 그 온도 의존성은 39㎉/gmol의 activation energy를 가지는Arrhenius equation에 의해 정의되어질 수 있었다. 2) 37℃에서 단위 세포당 실제retroviral vector의 생산성은 24.4(±7.0; 표준편차) colony forming unit (CFU)/cell/day였다.두가지 요소(생산과 inactivation)의 dynamic interplay상 가장 효율적으로 retroviral vector를 생산하는 적당한 온도 조건은 34℃이였다. 4) 세포 성장 속도는 37℃에서 doublingtime이 26.8시간으로 가장 높았다. 이 모든 것을 종합하여 처음에는 세포가 성장하기에 가장 적당한 온도인 37℃에서 배양하는 two-step retroviral vector 생산 protocol을 쓰는 것이가장 경제적으로 높은 titer의 vector를 생산하는 방법이다. 이 결과들은 가장 적합한retroviral vector 생산 protocol로서 효율적인 retroviral vector 생산 system으로 사용될 수있을 것이다.

Abstract ▼

For an efficient production of retroviral vectors for genetherapy, the effect of serum concentrations in culture medium and temperature on theproduction and inactivation of retroviral vectors from the amphotropic producer cells(pMFG/ψ CRIP) was investigated in various cultivation met

For an efficient production of retroviral vectors for genetherapy, the effect of serum concentrations in culture medium and temperature on theproduction and inactivation of retroviral vectors from the amphotropic producer cells(pMFG/ψ CRIP) was investigated in various cultivation methods. The serumconcentration in the range of 1-10% did not show any significant influence on theinactivation of retroviral vector at 37℃. The half-life of the vectors at 37℃ was inthe range of 2.0-2.7 hours. However, te serum concentration significantly influencedthe cell growth as well as vector production. In a commonly used method cellconcentration and vector titer in 10% serum were 2.31×105 cells/㎠, 6.2(±0.7; 표준편차)×105 colony forming unit (CFU)/㎖, respectively. On the other hand, the maximumcell concentration and vector titer in 1% serum were only 1.12×105 cells/㎠, 1.3(±0.3)×105 (CFU)/㎖, respectively. Furthermore, a daily medium exchange did not enhance thecell growth and vector production in 1% serum. However, in 10% serum, a dailymedium exchange allowed further cell growth and thereby enhanced the maximumvector titer (1.1(±0.1)×106 (CFU)/㎖). In addition, since it also improved themanitenance of high cell concentration, the vector could be produced throughout 16 daysculture, suggesting the feasibility of perfusion culture system for continuous productionof high titer retrovial vector.The retroviral titer obtained from the pMFG/CRIP producer cell line is determinedby a dynamic interplay of vector production and deactivation rates. Both these ratesare influenced by temperature. It was determined that ; i) the retroviral half-lives arestrongly influenced by temperature and the temperature dependency can be described bythe Arrhenius equation with an activation energy of 39㎉/gmol; ii) the actual retroviralvector productivity per cell is highest at 37℃ with retroviral production rate of 24.4(±7.0; standard deviation) colony forming unit (CFU)/cell/day; iii) the dynamic interplayof these two factors produces an optimal temperature of 34℃ for pMFG/CRIP cellsunder the culture conditions used ; and iv) the cellular growth rate is highest at 37℃at 26.8 hr doubling time. Taken together, these parameters can be used to optimize atwo-step retroviral production protocol, whiere the cells are first grown under optimalgrowth conditions (37℃) and second, the virus is produced at 34℃ to yield the highesttiter. These results have significant implications for optimal retroviral productionprotocols.

목차 Contents

• 1.서론...12
• 2.실험 재료 및 방법...14
• 3.결과...18
• 3-1. 혈청 농도가 retroviral vector 생산에 미치는 영향...18
• 3-2. 온도가 retroviral vector 생산에 미치는 영향...25
• 4. 고 찰...32
• 5. 결론...34
• 6. 인용문헌...35