초록 ▼

일반적으로 유전자 발현의 수준은 하나 또는 여러 개의 전사조절부위에 특정 조절 단백질이 결합하여 한 유전자의 전사개시에 복합적으로 영향을 미침에 따라 결정되어지며, 아미노산 생합성에 관여하는 효모 유전자들은 특정경로내에서 공동조절계뿐만 아니라, 서로 다른 생합성경로간에 이루어지는 일반조절과 경로 최종산물의 첨가에 의해 효소발현이 억제되는 특이조절등에 의하여 그 발현이 제어, 조절되고 있다. 유전자 발현요소로 TATA 요소 이외에 in trans 또는 in cis로 작용하는 UAS(upstream activatingsequen

일반적으로 유전자 발현의 수준은 하나 또는 여러 개의 전사조절부위에 특정 조절 단백질이 결합하여 한 유전자의 전사개시에 복합적으로 영향을 미침에 따라 결정되어지며, 아미노산 생합성에 관여하는 효모 유전자들은 특정경로내에서 공동조절계뿐만 아니라, 서로 다른 생합성경로간에 이루어지는 일반조절과 경로 최종산물의 첨가에 의해 효소발현이 억제되는 특이조절등에 의하여 그 발현이 제어, 조절되고 있다. 유전자 발현요소로 TATA 요소 이외에 in trans 또는 in cis로 작용하는 UAS(upstream activatingsequence, 상부활성부위), URS(upstream repression sequence, 상부억제부위)등이 존재하며,이러한 조절요소와 특정단백질이 관여함으로써 발현이 촉진, 또는 억제되어 유전자 발현 수준을 결정하게 되는 것이다.본 연구에서는 효모 아미노산 threonine 생합성의 마지막 단계를 촉매하는 threoninesynthase 유전자 (THR4)의 발현조절기작을 규명하고자 하는 것으로 먼저, THR4 유전자의전사개시부위를 결정하기 위하여 primer extension을 실시한 결과 개시코돈 상류 -38과 -41번째 두곳에서 시작됨을 알 수 있었다. THR4 5'상류 부위를 대장균 lacZ와 융합시킨뒤이 유전자의 5' 말단으로부터 전사개시점을 향한 일련의 염기탈락 유도체를 만들어이들로억제 및 탈억제 배양조건하에서 β-galactosidase의 활성을 측정하고 기존의 밝혀진 발현조절인자와의 비교, 분석 결과 상류 -373에서 -271염기 사이에 억제부위(URS)가 존재하며,-271에서 -210, -183에서 -129염기 두 부위에 활성부위(UAS)가 존재함을 알 수 있었으며,기존의 인자와 유의할 만한 상동성을 가진 염기서열은 존재 않음을 볼때, -271에서 -279의8개 염기(5'-ACTACTGT-3')가 새로운 전사조절 신호인식 서열의 가능성을 암시하였다.또한 mRNA 수준의 조사결과 효소활성 수준과 일치하는 결과를 보여주었으며 이는 전사수준의 조절로 발현 조절부위의 존재를 뒷받침하였다.본 연구결과는 THR4 유전자의 발현조절 자체를 이해하는데 도움을 줄 뿐 아니라threonine metabolism 조절양상을 알고, 다른 아미노산 생합성 유전자 발현조절과 비교,분석되어 궁극적인 진핵생물의 유전자 발현 이해의 기초지식을 제공할 수 있을것으로 기대된다.

Abstract ▼

Generally, gene expression is regulated by controlling the rateof transcription initiation. The regulatory sequences control the expression level ofgene through interaction with specific regulatory proteins that act either positively toenhance or negatively to repress the expression. Bio

Generally, gene expression is regulated by controlling the rateof transcription initiation. The regulatory sequences control the expression level ofgene through interaction with specific regulatory proteins that act either positively toenhance or negatively to repress the expression. Biosynthesis of amino acid in yeastis regulated at two levels: the regulation of enzyme synthesis by control of geneexpression and the regulation of enzyme activity by control of metabolite flow betweencell compartments, The enzyme for amino acid biosynthesis also can be under generaland specific control, affected by metabolites of end products of the cross and specificpathway, respectively. Regulation by general control system for amino acidbiosynthesis is mediated by positive(GCN) and negative(GCD) regulatory genes.Specific control system is mediated by trans-acting and cia-dominant regulatoryelements.In this research, we analyzed deletion mutants of the THR4 promoter ofSaccharomyces cerevisiae in order to determine the DNA sequences involved inregulation oftranscription. In deletion experiments a sequence(URS) located betweenpositions -308 and -271 was found to be responsible for transcriptional repression of theTHR4 gene in yeast cells grown on derepression condition. Also, at least two otherupstream activation UAS responsible for the activation of THR4 expression underrepression condition were found to be located between positions -271 and -210, -183 and-129, respectively. The sequence was analyzed for the presence of reported eukaryotictranscriptional control sequences. No exact match to any other promoter or enhancerelement described was detected. But, the possibility remains that novel element islocated in -279 and -271(5'-ACTACTGT-3'). To determine whether the THR4 genewas regulated by upstream region, THR4 mRNA levels and the β-galactosidaseactivities from deletion mutants plasmid-borne THR4-lacZ gene fusions were measuredin wild-type strain grown on minimal medium. The results were in accord withresults of the enzymatic analysis. By primer extension the THR4 transcripts werefound tostart between positions -38 and -41 upstream of the initiation codon. Theseresults allows us to form a more general view of the regulation of threoninemetabolism, and to contribute to the knowledge of the regulatory mechanism ofeukaryotic gene expression.

목차 Contents

• 목 차...6
• 5. 본문...8
• I. 서론...8
• II. 재료 및 방법...11
• 1. 균주 및 플라스미드...11
• 2. 배양조건 및 시약...11
• 3. 핵산 취급 및 처리...14
• 4. 5' 말단 염기탈락유도체 조성 및 subcloning...15
• 5. 형질전환...16
• 6. $\beta$-galactosidase의 활성측정...17
• 7. Northern에 의한 전사수준 검색...17
• 8. Primer extension...19
• 9. 염기서열 결정...19
• III. 결과 및 고찰...21
• 1. THR4-lacZ 융합 유전자의 조성 및 해독활성...21
• 2. THR4 유전자의 전사개시부위의 결정...22
• 3. THR4 유전자 전사조절...25
• 4. THR4 유전자 상부 조절부위 염기서열 및 분석...25
• 6. 인용문헌...28
• 7. 논문발표목록서...34
• 8. 자체평가서...34