초록 ▼

K. marxianus inulinase를 S. cerevisiae SEY2102/pYI10 재조합균주로부터 과발현시켜 분리정제하여 그 효소학적 제특성을 조사하였다. 균체외로 분비생산(5.9 units/mL)된 inulinase를 PEG와 ammonium sulfate 침전을 통해 정제도 13.9배, 수율61.5%로 부분정제하였다. 재조합 inulinase의 비활성(specific activity)은 inulin 기질에서15.3 unit/mg-protein, sucrose에서 88.7unit/mg-protein로

K. marxianus inulinase를 S. cerevisiae SEY2102/pYI10 재조합균주로부터 과발현시켜 분리정제하여 그 효소학적 제특성을 조사하였다. 균체외로 분비생산(5.9 units/mL)된 inulinase를 PEG와 ammonium sulfate 침전을 통해 정제도 13.9배, 수율61.5%로 부분정제하였다. 재조합 inulinase의 비활성(specific activity)은 inulin 기질에서15.3 unit/mg-protein, sucrose에서 88.7unit/mg-protein로 S/I ratio는 5.8에 달하였다.SDS-PAGE 결과 재조합 inulinase의 분자량은 94-171 kDa, 야생형 inulinase는 90-124 kDa으로 전형적인 당단백질 형태의 broad band를 보여주었고, nondenaturing-PAGE 결과 재조합형이 야생형보다 더 치밀한 당쇄부가와 과당쇄화(hyperglycosylation)가 일어났고, dimer가 주된 형임을 알 수 있었다. 재조합형과 야생형 inulinases를 Endo-H로 처리한 결과 62kDa의 하나의 band로 이동되었고, 이것으로 재조합 inulinase에는 약 50% 정도가, 야생형에는 약 40%정도의 N-형 당쇄부가가 일어났음을 알 수 있었다. 또한, 60℃에서 재조합inulinase 활성의 반감기는 50분인데 반하여, 야생형은 15분이였다. 재조합 효소의 열안정성 증가는 과당쇄화에 기인하는 것으로 판단된다.재조합 inulinase 발현에 미치는 구성적 promoter의 강도를 비교하기 위해서pYIGP(GAPDH promoter), pADH1-INU(ADH1 promoter), pENO-INU(ENO1 promoter)plasmid를 구축하여 비교적 균체 증식속도가 빠른 SEY2102 균주에 형질전환하고 YPD 배지에서 배양하였다. 배양 60시간에 최종 균체농도와 최대 inulinase 발현량은SEY2102/pYIGP 균주의 경우29.6 OD600 (9.47 g-DCW/L)와 1.09 unit/mL,SEY2102/pADH1-INU 균주의 경우 32.4 OD600(10.4 g-DCW/L)와 0.82 unit/mL,SEY2102/pENO-INU 균주의 경우 26.7 OD600 (8.54 g-DCW/L), 0.65 unit/mL를 각각 보였다. Plasmid 안정성은 SEY2102/pADH1-INU 균주와 SEY2102/pENO-INU 균주는 90%이상의 높은 plasmid 안정성을 유지하는 반면에, SEY2102/pYIGP 균주는 35%의 낮은 안정성을 보였다. 결론적으로 구성적 promoter의 강도는 GAPDH, ADH1, ENO1 promoter 순이었으며, plasmid 안정성은 ADH1과 ENO1 promoter가 GAPDH 보다 훨씬 안정하였다.Promoter 강도가 가장 우수한 GAPDH 발현계에서 탄소원으로써 inulin (Jerusalemartichoke/Dahlia/Chicory 등 세 종류)의 영향에 따른 균체증식과 inulinase 발현을 알아보기위해서 발현량이 높은 SEY2102와 2805(분비효율이 80%이상) 두 균주에 pYIGP plasmid를형질전환시켰다. 두 균주 모두 최종균체농도는 27-33 OD600 값을 보이며, 배양 36시간이후에도 균체증식은 느리지만 계속 일어나며 그 증식에 따라 inulinase도 계속적으로 발현생산되었다. 배양 48시간에 총발현된 inulinase는 SEY2102/pYIGP의 경우 약 0.8-1.1unit/mL, 2805/pYIGP의 경우 약 2.3-2.8 unit/mL 수준이였다. Jerusalem artichoke inulin을 탄소원으로 사용했을 때 dahlia나 chicory inulins 때 보다 균체농도는 10-20%, 발현량은20-30%, ethanol 생성은 2-3배 높게 나타났다. 따라서, 탄소원으로 inulin의 효용성 제고및 구성적 발현계에 의한 inulinase 분비생산에는 2805/pYIGP 계가 최적의 host-vector계로판단되었다.이상의 결과로부터 과당쇄화에 의해 열안정성이 크게 향상된 재조합 inulinase를 균체외로 분비생산할 수 있었으며, 이 효소를 이용(고정화 등)하여 식품소재 개발(돼지감자로부터 과당시럽), 기능성 농축산 소재(소화흡수율이 증가된 가축사료) 등의 개발과 재조합 효모를 이용한 돼지감자(inulin)의 동시당화발효공정(SSF) 개발(고순도 에탄올 생산) 등 다양한분야에의 활용 가능성을 보여주었다.

Abstract ▼

The inulinase gene of Kluyveromyces marxianus wasoverexpressed by using GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. The recombinantinulinase produced in the extracellular medium was partially purified by ammoniumsulfate precipitation and polyethylene glycol treatment. The specific activi

The inulinase gene of Kluyveromyces marxianus wasoverexpressed by using GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. The recombinantinulinase produced in the extracellular medium was partially purified by ammoniumsulfate precipitation and polyethylene glycol treatment. The specific activity of purifiedrecombinant inulinase was 15.3 unit/mg-protein toward inulin and 88.7 unit/mg-proteintoward sucrose, resulting in the S/I ratio of 5.8. The recombinant inulinase migratedas a disperse band at 94 to 171 kDa on SDS-polyacrylamide gel. The deglycosylatedforms of recombinant and wild-type inulinases showed a distinct band at 62 kDa. Thecarbohydrate contents of recombinant and wild-type enzymes were estimated to beabout 50% and 40% (w/w), respectively. The half life of the recombinant enzymeactivity at 60℃ was about 50 min, whereas the wild-type was about 15 min. Theenhanced thermal stability seems to be due to the higher content of carbohydrate moeitythan that of the wild-type inulinase.To investigate the constitutive promoter strength on the inulinase gene (INU1)expression, the recombinant plasmids pYIGP, pENO-INU, pADH1-INU were constructedto contain GAPDH, ENO1, ADH1 promoters, respectively. When the yeasttransformants were cultivated on YPD media, the final biomass and expression levels ofinulinase reached 29.6 OD600 (9.47 g-DCW/L) and 1.09 unit/mL for SEY2102/pYIGP,32.4 OD600(10.4 g-DCW/L) and 0.82 unit/mL for SEY2102/pADH1-INU, and 26.7 OD600(8.54 g-DCW/L) and 0.65 unit/mL for SEY2102/pENO-INU. While the ADH1 andENO1 promoter systems showed a plasmid stability of higher than 90%, the GAPDHpromoter plasmid revealed a low plasmid stability of 45% at the end of cultivation.This result indicates that the promoter strength was in the order GAPDH, ADH1, andENO1 promoter.When various Saccharomyces cerevisiae strains were transformed with a 2μ-basedmulticopy expression vector, pYIGP, carrying Kluyveromyces marxianus inulinase geneunder the control of GAPDH promoter, two strains of SEY2102 and 2805 were selectedto study their fermentation properties on inulin. Among three inulin sources, Jerusalemartichoke inulin was the most effective carbon source for cell growth (10∼11 g-DCW/Lat 48 hr) and inulinase expression (1.1 unit/mL with SEY2102/pYIGP and 2.8 unit/mLwith 2805/pYIGP) than dahlia or chicory inulin: Jerusalem artichoke inulin resulted in 10∼20% higher cell growth, 20∼30% greater expression level, and 2-3-fold higherethanol production than dahlia or chicory inulin.As a consequence, these results indicate that recombinant S. cerevisiae cellssecreting inulinase or the recombinant inulinase with increased thermal stability could beused to produce food materials(high-fructose syrup) and feedstuffs(enhanced digestibility)from inulin, and to develop the simultaneous saccharification and fermentation of inulinto ethanol.

목차 Contents

• 본문...7
• 1. 서론...7
• 2. 실험재료 및 방법...10
• 3. 결과 및 고찰...14
• 4. 결론...20
• 5. 인용문헌...21
• 1. 연구수행관련 논문발표 목록서...43
• 2. 자체평가서...44