초록 ▼

CytochromeP450의 촉매 기작에서 I-helix의 threonine은 안정한산소 분자의활성화를 위하여 protn donor로 작용하는 반드시 필요한 아미노산으로서 필수적인 기능을 수행한다고 알려져 왔다. 본 연구에서는 A245T, A245S, A245G,A245V,S246A, A246S/S246A 변이 효소들을 제조, 정제하였고 이들 효소들을 대상으로UV-VIS spectrum, CO-complex에 대한 분광학적 연구, CD-spectrum 분석, NADPH 산화속도 비교 분석, er

CytochromeP450의 촉매 기작에서 I-helix의 threonine은 안정한산소 분자의활성화를 위하여 protn donor로 작용하는 반드시 필요한 아미노산으로서 필수적인 기능을 수행한다고 알려져 왔다. 본 연구에서는 A245T, A245S, A245G,A245V,S246A, A246S/S246A 변이 효소들을 제조, 정제하였고 이들 효소들을 대상으로UV-VIS spectrum, CO-complex에 대한 분광학적 연구, CD-spectrum 분석, NADPH 산화속도 비교 분석, erythronolideB 의 형성 속도를 비교 분석하는 연구들을 수행하였다.UV-VIS spectrum, CO-complex에 대한 분광학적 연구, CD-spectrum 분석결과로 부터 제조된 모든 변이 효소들은 cytochromeP450의 기본적 구조를 잃지 않았음을 알 수 있었으며3차 구조상의 큰 변화를 보이지도 않았다. 따라서, 반응 속도 분석 결과들은 고안도니 특정 아미노산의 촉매적 기능과 직결된다고 할 수 있다. cytochromeP450의 촉매 기작에서필수적인 기능을 수행한다고 알려진 thronine으로 치환된 A245T 변이 효소의 효소 활성은wild type이나 다른 변이 효소에 비하여 매우 낮음을 알 수 있었으며, water-519와 상호 작용하여 proton 의 shuttling 에 주요 역할을 하리라고 제안된 Serine-246의 기능을 확인하기위하여 제조된 S246A, A246S/S246A 변이 효소들의 반응 속도 분석 결과 S246의 역할이중요하기는 하나 필수적이라고 할 수는 없었다. 그러나,A245G,S246A와 같이 크기가 작고,기질과 소수성 상호 작용을 할 수 있는 아미노산으로 치환도니 변이 효소들의 경우erythronolide B의 생성 속도가 wild type의 70-80 %에 이를 수 있었다. 따라서, EryF의촉매 기작에서 기질 결합 부위에 존재하는 아미노산과 기질의 소수성 상호 작용과 sterichindrance는 촉매 기작에 중요한 역할을 하며, 이러한 소수성 microenvironment를 이루는기질 결합 부위에서 산소의 활성화를 위한 proton donor는 기질의 C-5-OH, C-9-OH(분자내 케탈 형성)가 될 수 있을것으로 생각된다.

Abstract ▼

The threonine residue in the I-helix has been known to be anessential amino acid to activate a stable oxygen molecule as an proton donor in themechanism. In an effort to asses the role of threonine in the mechanism of P450, wedesigned and prepared A245T, A245S, A245G, A245V, S246A, A246S/

The threonine residue in the I-helix has been known to be anessential amino acid to activate a stable oxygen molecule as an proton donor in themechanism. In an effort to asses the role of threonine in the mechanism of P450, wedesigned and prepared A245T, A245S, A245G, A245V, S246A, A246S/S246A mutantenzymes. Based on their UV-VIS spectra, characteristic absorptions of of CO-complex,and CD-spectra,all mutant enzymes preserved basic P450 structure and any change in3-dimensional structure was not detected. Therfore, results on rates of NADPHoxidation and formation of erythronolide B could be assigned to the chracteristic funtionof each substituted amino acid in mutant enzymes. A245T mutant showed lowestactivity among tested mutant enzymes, which indicated that threonine hydroxyl groupwas not essential in catalytic cycle of EryF. Since the activities of S246A andA246S/S246A mutants were 70 % and 12 % of wild type in terms of formation oferythronlide B, the funtion of Serine-246 as a proton shuttle is not likely.However,such mutant enzymes substituted by small and hydrophobic amino acids asA245G and S246A maintaind 70-80 % activity compared with wild type. These resultsindicated that the proton donor for shuttling should be in the substrate. The possiblecandidates for the proton donor would be C-5-OH or C-9-OH resulting fromintramolecular ketal formation in the substrate.

목차 Contents

• 목 차...6
• 1. 서론...7
• 1) 연구배경...7
• 2) 연구목적 및 범위...11
• 2. 연구방법 및 이론...13
• 1) 자리-지정 돌연변이 전략 수립의 이론적 배경...13
• 2) 연구내용, 범위 및 방법...14
• 3. 결과...18
• 1) 변이 효소의 제조...18
• 2) EryF 변이 효소에 대한 spectral studies...20
• 3) EryF 변이 효소 반응 분석...25
• 4. 고찰...28
• 5. 결론...28
• 6. 인용문헌...29
• 7. 연구 수행 관련 논문 발표 목록서...30
• 8. 자체 평가서...31