보고서 정보
주관연구기관 |
한양대학교 HanYang University |
연구책임자 |
조기승
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참여연구자 |
신성섭
,
박귀덕
,
이상민
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 1996-02 |
주관부처 |
과학기술부 |
사업 관리 기관 |
한양대학교 HanYang University |
등록번호 |
TRKO200200018033 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
Phosphatidylinositol.Phosphatidy1-4-monophospate.Phosphatidyl 4.5-bisphosphate.Gas Chromatography.Signal Pathway.
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초록
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Phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC)에 의해시발되는 세포 신호전달과정에서 inositol phosphatides인 phosphatidylinositol(PI),phosphatidylinositol 4-monophosphate(PIP) 및 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)는 second messenger인 diacylglycerol(DG)과 endoplasmic reticulum(ER)으로부터 세포질내의 Ca
Phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC)에 의해시발되는 세포 신호전달과정에서 inositol phosphatides인 phosphatidylinositol(PI),phosphatidylinositol 4-monophosphate(PIP) 및 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)는 second messenger인 diacylglycerol(DG)과 endoplasmic reticulum(ER)으로부터 세포질내의 Ca2+ 농도를 증가시키는 inositol 1,4,5-triphosphate(IP3)를 생성하는 중요한 inositol 인지방질이다. 지금까지 inositol phosphatides를 정량하는 방법으로는 HPLC를 이용하거나,지방질을 TLC로 분리추출하여 무기인 정량으로 환산하거나 방사성 동위원소등을 사용하여왔다. 이와같은 방법들을 inositol 인지방질 정량이나 효소학적 연구에서 조작이 복잡하고시간이 오래 걸리며, 고가의 동위원소 표지화합물을 필요로 하므로, 이와 같은 단점을 보완하기 위하여 gas chromatography(GC) 법으로 inositol phosphatides를 정량할 수 있는 방법을 고안하였다.GC 분석에 사용된 column은 6ft의 open tubular stainless column (3.2mm i.d.)으로서100/120mesh chromosorb WAW에 10% SP-2330 liquid phase(68% cyanopropyl, 32%phenylsiloxane)를 Coating시킨 resin을 충진시켜 사용하였다.GC 운영조건으로 column과 injector온도는 250℃, detector 온도는 300℃ 등온 상태를유지시켰고, 운반기체로는 99.99% 순도의 N2 gas를 사용하였으며, 유속은 40ml/min으로 조정하였다. 표준 inositol 인지방질인 PI, PIP, PIP2를 분석한 결과 retention time(머므름시간)은 각각 17.6±0.42, 13.4±0.12 및 10.5 ±0.37분으로 나타났는데, 이 값은 절대값이 아니며 column의 충진조건에 따라 평균오차내의 편차를 보였다.이와 같이 retention time(머무름시간)을 측정한 후 각 inositol 인지방질의 증(10㎍단위)에 따른 각 peak면적의 증가를 측정하여 정량곡선을 작성하였고, 이 표준곡선에 의해 생체조직으로부터 inositol 인지방질의 정량과 PI 기질에 의한 PI-PLC 효소연구 및 PI4-kinase 효소연구에 대한 응용성에 대해 고찰하였다.
Abstract
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Inositol phosphatides(PIs), that is, phosphatidylinositol(PI),phosphatidyl-inositol 4-monophosphate(PIP) and phosphatidylinositol4,5-bisphosphate(PIP2) have been known a pivotal phospholipids in cellular signaltransduction system triggered from PI-specific phospholipase
Inositol phosphatides(PIs), that is, phosphatidylinositol(PI),phosphatidyl-inositol 4-monophosphate(PIP) and phosphatidylinositol4,5-bisphosphate(PIP2) have been known a pivotal phospholipids in cellular signaltransduction system triggered from PI-specific phospholipase C(PI-PLC) which producesdiacylglycerol(DG) and inositol 1,4,5-triphosphate(IP3) as a second messenger.IP3 seems to act an increasing cytosolic Ca2+ concentration from endoplasmicreticulum(ER). So far, there have been reported several methods for measurement ofPIs, such as HPLC methods, inorganic phosphorus determination of PIs after TLCseparation and isotope labelling, but those are complicated, tedious and time-consumingprocesses. So we developed a fast, simple and low cost method to analyze the PIs bygas chromatography.Gas chromatographic analysis of PIs was accomplished by open tubular stainlesscolumn (6ft long, 3.2mm, i.d) packed with 100/120mesh chromosorb WAW coating with10% SP-2330 liquid phase (68% cyanopropyl, 32% phenylsiloxane). GC operatingconditions are as follows ; column and injector temperature : 250℃, detector temperature: 300℃, carrier gas : 99.99% N2 gas and flow rate : 40㎖/min. GC analysis of thestandard PI, PIP and PIP2 represented the different retention times of 17.6±0.43, 13.6±0.12 and 10.2±0.37 min, respectively. Those values are not absolute and variationsdepend on the condition of column packing.The standard cruve was prepared from the retention times of increasingconcentrations of authentic standard Pis. This method can be applicable for thequantitative analysis of inositol-containing phospholipids in biological systems.Furthermore, it is proved to be useful for the enzymatic kinetic studies, such as PI-PLCand PI-kinase on PI substrate.
목차 Contents
- I. 서론...8
- I. 실험 재료 및 방법...12
- 1. 실험 재료...12
- 2. 실험 방법...13
- III.결과 및 고찰...16
- 1. 표준 Inositol 인지방질의 분리 및 확인...16
- 2. GC법에 의한 표준 Inositol 인지방질의 정량곡선과 VBR assay법에 의한 정량곡선의 비교...16
- 3. 생체조직에서 Inositol 인지방질의 정량분석...22
- 4. GC분석법에 의한 Phospholipase C 활성도 측정...24
- 5. GC분석법을 이용한 PI'4-kinase 활성도 측정...24
- IV. 결론...31
- References...32
- 논문 발표 실적 또는 계획...35
- 학위 배출 실적...35
- 연구비 항목별 집행 내역( 영수증 : 연구처 보관 )...36
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