초록 ▼

유전자 증폭방법을 사용하여 신속하면서도 간편한 대장균의 검출법을 개발하는 기반 연구를 수행한다. 먼저 대장균 유전자 염기서열로부터 PCR에 필요한 시발물질(primer)을 고안하고 대장균에 대하여 PCR을 수행하여 가장 예민하면서도, 특이적이며 신속한 대장균 검출법을 개발하여 우리나라의 대표적인 도시락인 김밥에서의 대장균 검사에 적용한다. 유전자 증폭에 의하여 김밥으로부터 하루만에 대장균의 존재여부를 검사하는 방법은 다음과 같다. 1. 유전자증폭기: Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 2400. 2. 유전자증폭

유전자 증폭방법을 사용하여 신속하면서도 간편한 대장균의 검출법을 개발하는 기반 연구를 수행한다. 먼저 대장균 유전자 염기서열로부터 PCR에 필요한 시발물질(primer)을 고안하고 대장균에 대하여 PCR을 수행하여 가장 예민하면서도, 특이적이며 신속한 대장균 검출법을 개발하여 우리나라의 대표적인 도시락인 김밥에서의 대장균 검사에 적용한다. 유전자 증폭에 의하여 김밥으로부터 하루만에 대장균의 존재여부를 검사하는 방법은 다음과 같다. 1. 유전자증폭기: Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 2400. 2. 유전자증폭용 튜브: PCR용 0.2ml 짜리 얇은 벽 튜브. 3. 유전자 중합효소: Tca DNA polymerase (바이오니아, 한국) 또는 Taq DNA polymerase (Boehringer mannheim, 독일)와 dNTP. 4. PCR 프라이머: 1차 PCR용 프라이머는 정방향의 것은 5′-CCCGTTGACT GCCTCTTCGCTGTAC-3′을 사용하며 2차 PCR용의 정방향 프라이머는 5′-CATCGCAGCGTAATGCTCTACACCA-3′, 역방향 프라이머는 5′-TATCGAATCCTTTGCCACGCAAGTC-3′을 사용한다. 5. 주형 DNA의 제조; 김밥 5g을 Tryptic soy broth 배지 20㎖에 넣고 37℃에서 밤새 배양한다음 상등액을 100℃에서 10분간 가열하여 주형 DNA로서 사용한다. 6. PCR 반응액의 조성: 1차 PCR은 주형 DNA 용액 2㎕, 반응완충액(10 x) 2.5㎕, dNTP(10 mM) 2 ㎕, primer(sense or antisense 50 pmole) 2 ㎕, Taq DNA Polymerase 0.25 uit를 넣고 멸균된 2차 증류수로 전체 부피가 25㎕가 되게 한다. 2차 PCR은 1차 PCR에서 증폭된 용액 0.5㎕를 주형 DNA로 사용하는 것을 제외하고는 1차 PCR과정과 같다. 7. PCR반응의 조건은 pre-denaturation 94℃/5분, denaturation 94 ℃/15초, annealing 65 ℃/15초, extension 72 ℃/20초, post-extension 72 ℃/5분으로 PCR은 20회를 반복 수행토록 한다. 1차 및 2차 PCR산물의 크기는 각각 835 bp와 412 bp이다. 8. PCR 반응액은 1.5% 아가로즈 젤에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하고 자외선을 조사하여 DNA의 증폭여부를 관찰하고 그 결과는 사진으로 보관한다.

Abstract ▼

Basic research is performed to develop and rapid and simple E. coli detection method using PCR technique. First, PCR primers are designed based on genomic DNA sequences of E. coli. Then a sensitive, specific, and rapid E. coli detection method is developed and the method is applied to the detection

Basic research is performed to develop and rapid and simple E. coli detection method using PCR technique. First, PCR primers are designed based on genomic DNA sequences of E. coli. Then a sensitive, specific, and rapid E. coli detection method is developed and the method is applied to the detection of the microorganism from Korean typical lunch box, Kim-bab. The E. coli detection method from Kim-bab for a day is as follows. 1. Machine: Perkin-Elmer GeneAmp PCR system 2400 2. PCR tube: 0.2 ml thin wall-PCR tube 3. DNA-polymerase: Tca DNA polymerase from Bioneer, Korea or Taq DNA polymerase from Boehringer mannheim, Germany. 4. Primers for PCR: Forward and reverse primers for primary PCR are 5′-GATGGAGCATCAGGGCGGCTATACG-3′, 5′-CCCGTTGACTGCCTCTTCGCTGTAC-3′, respectively and those for secondary PCR are 5′-CATCGCAGCGTAATGCTCTACACCA-3′. 5′-TATCGAATCCTTTGCCACGCAAGTC-3′, respectively. 5. Preparation of template DNA: Kim-bab(5g) is introduced to 20 ml of tryptic soy broth. Then the mixture is incubated overnight at 37℃ and the culture solution is used as a template DNA after heating for 10 min at 100℃. 6. Composition of PCR reaction mixture: Reaction mixture (25 ㎕) for primary PCR contains 2 ㎕ of template DNA solution, 2.5 ㎕ 10-fold reaction buffer, 2 ㎕ of dNTP (10 mM), 2 ㎕ of sense and antisense primers(50 pmole), and 0.25 unit of DNA polymerase. The mixture for secondary PCR was the same as that for primary PCR except 0.5 ㎕ of primarily amplified solution is used as template DNA instead of cell lysate solution. 7. Reaction condition for PCR is pre-denaturation 94℃/5min, denaturation 94℃/15 sec, annealing 65℃/15 sec, extension 72℃/20 sec, and post-extension 72℃/5min with 20 cycles from denaturation to extension steps. Sizes of the PCR products from primary and secondary PCR are 835 bp and 412 bp. 8. Reaction products are analyzed by gel electrophoresis on 1.5% agarose and the amplified DNAs are visualized by uv-light irradiation followed by photograph.

목차 Contents

• 제 1 장 서론...14
• 제 2 장 국내$ \cdot $외 기술개발 현황...16
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...17
• 제 1 절 재료 및 방법...17
• 1. 균주 및 미생물의 배양...17
• 2. PCR을 위한 프라이머의 합성...17
• 3. PCR을 위한 프라이머의 선정...19
• 4. 유전자 증폭 방법...24
• 5. 제놈 DNA의 추출...25
• 6. Kit를 사용한 E. coli(ATCC 11835)의 genomic DNA 추출...26
• 7. 대장균의 DNA 양에 따른 PCR...27
• 8. 대장균의 생균수의 측정과 생균수에 따른 direct PCR...27
• 9. 희석 용액으로부터 추출한 제놈 DNA에 따른 PCR...27
• 10. E. coli를 묻힌 밥으로부터 PCR에 의한 E. coli 검출...28
• 11. PCR을 이용한 시판용 김밥으로부터 대장균의 검출...28
• 제 2 절 연구 결과...29
• 1. 균주들의 제놈 DNA의 전기영동...29
• 2. 프라이머 쌍의 선정...29
• 3. Annealing 온도와 프라이머쌍에 따른 E. coli 제놈 DNA의 증폭...29
• 4. 대장균 제놈 DNA의 PCR 반응 특이성...34
• 5. 대장균의 DNA 양에 따른 PCR 산물...34
• 6. 대장균의 생균수에 따른 직접적인 PCR...40
• 7. 희석 용액으로부터 추출한 제놈 DNA에 따른 PCR...40
• 8. 대장균을 오염시킨 밥으로부터 PCR에 의한 대장균의 검출...45
• 9. 시판용 김밥으로부터 PCR을 이용한 대장균의 검출...51
• 제 3 절 고찰...54
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...56
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...56
• 제 6 장 참고문헌...57