초록 ▼

1. CRP 분리정제 : a) 폐렴구균의 세포막으로 부터 C-polysaccharide(CPS)를 분리하여 CRP를 측정할 수 있는 효소면역측정법(EIA)를 개발하였다. 또한 이 CPS를 이용하여 affinity column을 만들어 CRP 분리정제에 이용하였다. b) 환자의 복수로부터 CRP를 높은 수율로서 순수하게 분리정제할 수 있는 간이정제법을 개발하였다. 이 방법은 P-diazonium phenyl phosphory-lcholine(DPPC)를 이용하여 affinity column을 제작하여 사용했으며 CPS와 DPPC에

1. CRP 분리정제 : a) 폐렴구균의 세포막으로 부터 C-polysaccharide(CPS)를 분리하여 CRP를 측정할 수 있는 효소면역측정법(EIA)를 개발하였다. 또한 이 CPS를 이용하여 affinity column을 만들어 CRP 분리정제에 이용하였다. b) 환자의 복수로부터 CRP를 높은 수율로서 순수하게 분리정제할 수 있는 간이정제법을 개발하였다. 이 방법은 P-diazonium phenyl phosphory-lcholine(DPPC)를 이용하여 affinity column을 제작하여 사용했으며 CPS와 DPPC에 대한 CRP결합력을 비교분석하여 CRP의 순도와 수득율을 높일 수 있었다. 또한 $Ca^{+2}$의 친화력을 이용한 Hydroxylapatite(HA)를 병용하여 CRP를 간편하고 순수하게 분리정제했으며, 순수 CRP의 특성을 조사하였다. c) 분리한 CRP는 SDS-PAGE에서 단일밴드로 나타났으며 immunoelectrophoresis에서도 단일 침전 arc로 나타나 순수분리되었음을 확인하였다. 또한, Sephacryl S-200 gel filtration과 SDS-polyacrylamide gel 전기영동 분석결과에 의하면 분자량은 118,000으로서 5개의 동일한 subunit로 구성되어 있으며 그 subunit의 분자량은 23,600이었다. CRP의 isoelectric point는 4.82였으며 500ml의 복수로부터 분리된 CRP의 회수율은 약 67%로서 4.7mg이었다.2. CRP 항체 생산 a) 분리정제된 CRP를 balb/C mouse에 주사하고 hybridoma기법을 이용하여 CRP에 대한 모노클론날항체를 생산하였다. 생산된 항체는 IgG₁이었으며, protein G-affinity column으로 분리정제했을때 ascitic fluid중 순수항체는 2.8mg/ml이었다. 또한 CRP를 토끼에 주사하여 폴리클론날항체를 만들어 latex응집슬라이드법에 이용했으며, 항체의 역가는 latex응집법으로 측정했을 때 $2^5-2^8$이었다. b) 생산된 항체를 이용하여 단일침전확산법(SRID)와 CPS를 이용한 EIA법을 개발하여 환자의 혈청내에 있는 CRP양을 정량적으로 측정할 수 있었으며, CRP의 활성도를 측정할 수 있었다.3. 건식법개발을 위한 착색고상형면역항체개발 ; latex 응집 슬라이드법 개발 순수 분리정제된 면역항체를 latex입자에 감작시킨 후 latex 응집법을 이용한 CRP 간이측정법을 개발하여 임상진단에 이용하였다. 이 방법은 혈청시료를 사용하여 3분이내에 CRP 여부를 판정할 수 있었다. 검출범위는 0.5-20mg/dl이며, 0.8-2.2mg/dl에서는 강한 반응을, 2.2-9.8mg/dl에서는 약한 반응을 나타내며, 28mg/dl 이상에서는 음성 반응을 나타냈다. 30명의 환자혈청을 시료로하여 본 연구에서 개발한 방법과 2종류의 상품인 CRP-slidex(Bio Merieux Co.,France)와 CRP-latex(일수제약, 일본)을 사용하여 얻은 결과를 비교했을 때 좋은 상관성을 나타내었다. 74명의 환자혈청을 조사했을 때 CRP 평균치는 3.8mg/dl이었으며, 대부분 CRP값은 10mg/dl 이하이었다. 이와같은 평가분석을 통해 볼 때, 본 연구에서 개발한 agglutination slide test는 그 사용이 간이하며 신빙성이 있어 CRP를 스크리닝하는데 효과적임을 알 수 있었다.

Abstract ▼

C-reactive protein (CRP) is a protein that appears in the sera of human and most mammals in response to certain types of acute inflammation. Therefore, it has been utilized as marker of acute inflamation. In 1930, Tillet and Francis first described the presence of this protein in the sera of patien

C-reactive protein (CRP) is a protein that appears in the sera of human and most mammals in response to certain types of acute inflammation. Therefore, it has been utilized as marker of acute inflamation. In 1930, Tillet and Francis first described the presence of this protein in the sera of patients with acute pneumonia. The naming of CRP originated from the precipitation reaction of CRP with pneumococcal C-polysaccharide (CRP : Abernethy, 1937 ; Anderson & McCarty, 1951). In recent years, the structure and function of CRP have become under intensive investigation and a number of in vitro reactivities of this acute phase protein have been published. They include activation of the classical complement pathway (Kaplan and Volanakis, 1974 ; Osmand et al., 1975), enhancement of phagocytosis (Kindmark, 1971 ; Mortensen et al., 1976), inhibition of platelet aggregation and mediator release reactions (Fiedel and Gewurz, 1976 : fiedel et al., 1977), and interactions with certain subpopulations of T-lymphocytes (Mortensen et al., 1975 ; Croft et al., 1976). Further studies of these phenomena and their relationship to the biological function of CRP depend to a great extent on the availability of highly purified protein. The objective of this study is to develop the simple method to detect CRP in serum. To develop such a method, CRP was purified from pleural fluid, and produced specific antibodies to CRP. The latex agglutination method was developed and evaluated to measure CRP in patient serum. The results obtained are summarized as follows. 1. CRP purification : A simplified procedure for obtaining high purity and high yield of C-reactive protein was established. The CRP from ascitic and pleural fluid was purified using calcium dependent affinity chromatography of CNBr-activated Sepharose-4B covalently coupled to p-diazonium phenylphosphorylcholine (DPPC) and hydroxylapatite chromatography. The active fractions of CRP during the purification procedure were determined by EIA using pneumococcal C-polysaccharide. The final recovery of CRP was 67% of the initial protein amount as quantitated by single radial immunodiffusion (SRID), and the purification fold was 3,600. The purified CRP was shown to be homogeneous by electrophoresis and immunoelectrophoresis. The molecular weight of CRP was approximately 118 KD as determined by Sephacryl S-200 gel filtration and the molecular weight of a subunit was approximately 23.6 KD by SDS -polyacrylamide gel electrophoresis. The isoelectric point of CRP was found to range about 4.82. 2. Antibody preparation : Monoclonal antibody : Hybridoma cell line "CRPABI" was prepared and highly specific monoclonal antibody was selected using the indirect EIA method. This clone produced IgG₁subtype antibody and the amount of antibody produced was 2.8mg/ml ascitic fluid. Polyclonal antibody : The polyclonal antibody was prepared from rabbit and the titer level was found to be $2^5-2^8$ by the latex agglutination method. 3. Latex agglutination method : A sensitive latex agglutination slide test was developed to measure CRP within 3 min. by utilizing polyclonal antibody. The detection range was between 0.5mg/dl and 20mg/dl in serum, showing strong response in the range of 0.8-2.2 mg/dl, weak response in 2.2-9.8mg/dl and false negative over 28mg/dl. The CRP values of 30 patient serum samples were determined by the our method, and the values were compared with values obtained by two commercial kits, CRP-slidex (Bio Merieux Co., France)and CRP-latex (Ilsu pharm. Co., Japan). The average value of CRP in 74 patient sample was 3.8mg/dl and most of the values were lower than 10mg/dl. All performance characteristics evaluated make the agglutination slide test suitable for a simple, rapid and reliable screening of CRP in serum.

목차 Contents

• 제1장 서론...17
• 제2장 실험재료 및 실험방법...19
• 제1절 실험재료 및 기기...19
• 제2절 CRP의 분리정제...20
• 1. CPS-affinity chromatography...21
• 2. DPPC-affinity chromatography...21
• 3. Hydroxylapatite chromatography...22
• 제3절 CRP의 특성조사...22
• 1. 단일확산 침전법...22
• 2. 효소면역 측정법...23
• 3. CRP의 분자량 및 등전점 측정...23
• 제4절 건식법개발을 위한 착색고상형 면역항체개발...26
• 1. 분석법 개발...26
• 2. CRP 감작 latex 제조법...27
• 3. Radio-iodinated 항체 제조법...27
• 제5절 항체제조 및 정제...28
• 1. 폴리클론날 항체의 제조...28
• 2. 모노클론날 항체의 제조...28
• 3. 항체의 정제...32
• 4. SDS-PAGE...32
• 제3장 결과 및 고찰...34
• 제1절 CRP의 분리정제...34
• 제2절 CRP의 특성조사 : 농도, 순도, 분자량, 등전점...35
• 제3절 건식법개발을 위한 착색고상형 면역항체개발 ; latex 응집반응을 이용한 CRP 간이측정법...42
• 1. 항체의 radio-iodination...42
• 2. latex 입자에 결합되는 면역항체양 조사...42
• 3. Coupling 시간 영향...47
• 4. Agglutination slide법 개발...47
• 5. 분석법 및 평가...55
• 제4절 항체의 분리정제...59
• 1. 폴리클론날 항체의 분리정제...59
• 2. 모노클론날 항체의 분리정제...59
• 제4장 결론...62
• 참고문헌...64