초록 ▼

본 연구는 효율적인 연구 수행을 위하여 네 개의 세부과제로 구성되어 있다. 제 1 세부과제는 곤충기생균 유전자원 수집 및 분리동정에 관한 연구로써 국내에 분포 하는 곤충기생균 및 유용 유전자원의 수집, 분리와 형태학 및 분자수준의 분류동정 을 수행하여 정확한 국내 자생종의 분포현황을 조사하였다.
제 2 세부과제인 미생물 살충제 효능검정에 관한 연구에서는 원활한 시험해충 제공 및 생물검정을 위하여 주요 나방의 적합한 인공사육배지를 개발하였으며, 국내 에서 수집된 녹강균(Metarhizium anisopliae; Nomuraea

본 연구는 효율적인 연구 수행을 위하여 네 개의 세부과제로 구성되어 있다. 제 1 세부과제는 곤충기생균 유전자원 수집 및 분리동정에 관한 연구로써 국내에 분포 하는 곤충기생균 및 유용 유전자원의 수집, 분리와 형태학 및 분자수준의 분류동정 을 수행하여 정확한 국내 자생종의 분포현황을 조사하였다.
제 2 세부과제인 미생물 살충제 효능검정에 관한 연구에서는 원활한 시험해충 제공 및 생물검정을 위하여 주요 나방의 적합한 인공사육배지를 개발하였으며, 국내 에서 수집된 녹강균(Metarhizium anisopliae; Nomuraea rileyi)과 백강균 (Beauveria bassiana)을 대상으로 채소 및 화훼류에 심각한 피해를 주고 있는 파밤 나방, 담배거세미나방, 배추좀나방, 과수의 약제로 방제가 어려운 점박이 응애, 벼 에 있어서 주요한 해충인 벼멸구 등에 대하여 우수한 살충력을 지닌 균주를 탐색하 였다. 또한 배추좀나방에 대하여 우수한 살충력을 지닌 균주를 선발하여 충체표면에 붙은 포자수와 살충력과의 연관성, 온실과 포장에서의 방제효과를 조사하였다.
제 3 세부과제인 유전공학기법을 이용한 곤충기생균 살충력 향상에 관한 연구에 서는 곤충 기생균의 살충력 향상을 위해서 우선 곤충 기생균의 최적 배양조건 확립 을 하였고, 곤충 기생균의 protoplast 제조 방법 개발 및 곤충 기생균의 형질전환을 위한 재조합 plasmid 제조를 하였다. 그리고, 전기 충격법에 의한 곤충 기생균의 형 질 전환 기술을 개발하였다. 이러한 방법에 의해 형질 전환된 균주들의 분자 생물학 적 분석을 위해 형질 전환 균주로부터 chr. DNA분리를 하여, PCR 분석을 하였으며, 이들 균주로부터 total protein을 분리하여, protein의 SDS-PAGE 분석을 하였다. 그 리고, 형질 전환된 곤충기생균 제재의 살충력 시험을 실시하였다. 끝으로, 현재 살 충제로 많이 개발되어져 있는 Beauveria bassiana 균주의 형질을 전환시켰다.
제 4 세부과제인 곤충기생균의 대량배양 기술개발에서는 곤충기생균으로서 Metarhizium sp.와 Beauveria bassiana 726을 이용하여 성장조건을 확립하고, 특히 포자의 활성이 높은 것으로 밝혀진 B. bassiana 726을 이용하여 값싼 배지인 볏짚과 전처리된 당밀을 탄소원으로 하여 배지를 최적화하였고, 액체배양(회분식 및 유가식 배양), 고체배양, 이단계배양에 의한 균체의 대량배양과 포자생성을 위한 공정의 최 적화에 이용될 모델을 제시하였다. 또한 생산된 포자를 제형화 하였다.

Abstract ▼

A survey of entomopathogenic fungi was conducted in Korea from 1990 to 1998. A total of fungal-infected cadavers of insects and spiders were collected from varied habitats in different altitudial zones. From these specimens, 11 genera consisting of 67 species Ascomycota and Deuteromycota were isolat

A survey of entomopathogenic fungi was conducted in Korea from 1990 to 1998. A total of fungal-infected cadavers of insects and spiders were collected from varied habitats in different altitudial zones. From these specimens, 11 genera consisting of 67 species Ascomycota and Deuteromycota were isolated and identified on selecting media. Among them, there was new species Cordyceps yongmunensis Sung & Humber and 37 newly recorded species from Korea. The newly recorded species are described and illustrated. Of these arthropod fungal pathogens, the genus Cordyceps, Beauveria and Paecilomyces was most prevalent, 192, 319 and 256 specimens in order, followed in descending order by the genera Metarhizium, Hirsutella, Verticillium, Giberella. These arthropod fungal pathogens usually had a relatively broad but differential host range, except Hirsutella which selectively attacks scale insects, while Gibellula strictly parasitizes spider(Arachnida). For clear identification and classification, PCR-RFLPs, Isoelectric Focusing and Sequencing method were conducted. Also, ecological research on seasoning and geographical distribution for development and use of mycoinsecticide was discussed.
In order for development of mycoinsecticide, various isolates of entomopathogenic fungi including Metarhizium anisopliae, Nomuraea rileyi and Beauveria bassiana were screened to select the most virulent isolate against domestic insect pests(Spodoptera exigua, Spodoptera litura, Plutella xylostella(DBM), Teranychus urticae, and Nilaparvata lugens). Isolates of M. anisopliae used in the study showed low mortality against all test insect pests. Nomuraea rileyi 925 with 61% mortality against S. exigua has the capability to infect larvae of Noctuidae, but continuous collection of this species is necessary for higher virulent isolate. Among isolates used, B. bassiana 726 revealed the highest virulence against X. plutella with 86.23% and $LT_{50}$ of 1.63 days under the laboratory condition. In order to examine its potential as mycoinsecticide, intensive investigation was made under laboratory, greenhouse and field environments.
Treatment of conidial suspensions at various concentrations indicated that the $LT_{50}$ was $4.3\;{\times}\;10^6$ conidia/ml under the laboratory condition. Assessment of rigorous dose-response showed that at least 9,800 conidia of the strain 726 should adhere to a single DBM larva to induce successful infection. In the greenhouse assay, corrected mortality at $1\;{\times}\;10^8$ conidia/ml was 66.5% with $LT_{50}$ of 3.61 days.
The efficacy of the strain B. bassiana 726 in the field was 60.5% mortality with $LT_{50}$ of 4.91 days at $10^8$ conidia/ml. Persistence of conidia was equally short on both leaves and larvae due to unfavorable environmental conditions. Nevertheless, treatment of B. bassiana 726 potentially reduced larval populations, indicating that the strain 726 has the potential to use as mycoinsecticide against DBM larvae.
An insect parasite fungi is recently being interested for the development of microbial insecticide. In this report, we have focussed on the improvement of insecticidal activity in the fungi through the increasing the insecticidal spectrum by using the transformation with B.t.t.-toxin gene. For the purpose, the culture conditions for the fungi, at first, were established. The pure isolation of the protoplasts was successfully undertaken from the fungi. The plasmid vector pGDP-Btt and electroporesis method for the transformation were also developed. The transformed fungi could be selected on the PDB solid agar containing the hygromycin with 100ug/ml, and the expression of the gene in the transformed cells was identified by using the molecular biological assays. The transformed cells were cultured in the liquid mediun, for 7 days and harvested for the prepare of the cell powder. A series of biotests with Coleopteran larvae were undertaken by using the cell powder spreaded on the leaf surface. The biotests showed that the transformed cell had the insecticidal activity against the insect larvae. The results indicated that the insecticidal activity was improved in comparison with the wild type of the fungi. In addition to the results, we have transformed Beauveria sp. isolated in Korea by using the method avove easily. The transformation results have proved that the method above may be useful for the development of fungi showing the new insecticidal activity by using the genetical transformation.
In some developed countries, a biological pesticides made by entomopathogenic fungi were developed for a practical application. However, in Korea, it was not established for mass culture technique of a biological pesticide. This technique should be developed in this country for improving the productivity and saving the cost. In this study, mass culture techniques by liquid culture, solid culture, and diphasic cultures were established for the application of entomopathogenic fungi as a biological pesticide.
In this study, growth conditions of entomopathogenic fungi, Metarhizium sp. and Beauveria bassiana 726, were determined. Especially, media optimization and culture conditions in liquid culture(batch and fed-batch cultures), solid culture, and diphasic cultures were established for the production of cell mass and conidia, using very cheap substrates such as rice straw and molasses. Also, the model was suggested for the optimization of mass culture process. Based on these results of the study, the process for the pilot scale should be applied and optimized, thus applicable to the industrial scale.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 요약문...4
• SUMMARY(영문요약문)...9
• 목차...19
• 제 1 장 서 론...26
• 제 2 장 곤충기생균의 수집 및 분리동정에 관한 연구...29
• 제1절 서론...29
• 제2절 재료 및 방법...30
• 1. 곤충기생균의 수집과 분리...30
• 가. 곤충기생균 유용유전자원 수집 및 분리동정에 관한 연구...30
• 2. 채집된 곤충기생균의 분류, 동정 및 생리 실험...31
• 가. 채집된 곤충기생균의 분류동정...31
• 1) 미세구조적 형태학상의 특성에 따른 분류...31
• 나. 곤충기생균의 생태적 환경 조사...32
• 1) 한국산 곤충기생균의 분포상과 발생빈도 조사...32
• 다. 고부가성 유전자원의 탐색...32
• 라. 곤충기생균의 배양적 특성 조사...33
• 마. 분자수준의 분류체계 확립...33
• 1) 동위효소분석장치(IEF)를 이용한 분자수준의 분석...33
• 가) 곤충기생균 속 간의 동위효소 분석...33
• 나) Metarhizium속, Beauveria속, Cordyceps속간의 동위효소 분석...34
• 2) PCR-RFLPs기법을 이용한 분자분류...39
• 가) PCR-RFLPs기법을 이용한 곤충기생균 유전적 지표탐색...39
• 나) PCR-RFLPs기법을 이용한 Beauveria속균의 분자 분류...42
• 3) 염기서열 분석을 통한 Metarhizium anisopliae의 종내 변이주간의 분류...42
• 3. 균주의 장기보존법 개발...45
• 가. 동결건조를 이용한 보존방법 개발...45
• 나. 진공건조를 이용한 보존방법 개발...45
• 제3절 결과 및 고찰...46
• 1. 곤충기생균의 수집과 분리...46
• 가. 곤충기생균 유용유전자원 수집 및 분리동정...46
• 2. 채집된 곤충기생균의 분류, 동정 및 생리 실험...55
• 가. 채집된 곤충기생균의 분류동정...55
• 1) 미세구조적 형태학상의 특성에 따른 분류...55
• 가) 다양한 곤충기생균의 미세구조적 특징...55
• 나) Verticillium속의 불완전세대를 갖는 Cordyceps속균...55
• 다) Beauveria, Metarhizium속균의 형태학적 고찰...55
• 라) Metarhizium속균의 형태적 특성...55
• 마) Cordyceps specpcephala에 대한 형태적 특성 및 불완전세대와의 관계...56
• 바) Cordyceps 속균와 Beauveria속균간의 관계...56
• 나. 곤충기생균의 생태적 환경 조사...69
• 1) 한국산 곤충기생균의 분포상과 발생빈도...69
• 다. 고부가성 유전자원의 탐색...69
• 라. 곤충기생균의 배양적 특성...70
• 마. 분자수준의 분류체계 확립...75
• 1) 동위효소분석장치(IEF)를 이용한 분자수준의 분석...75
• 가) 곤충기생균 속 간의 동위효소 분석...75
• 나) Metarhizium속, Beauveria속, Cordyceps속간의 동위효소 분석...76
• 2) PCR-RFLPs기법을 이용한 분자분류...77
• 가) PCR-RFLPs기법을 이용한 곤충기생균 유전적 지표탐색...77
• 나) PCR-RFLPs기법을 이용한 Beauveria속균의 분자 분류...78
• 3) 염기서열 분석을 통한 Metarhizium anisopliae의 변종간의 분류...79
• 3. 균주의 장기보존법 개발...93
• 제4절 종합고찰...95
• 제5절 적요...98
• 제 3 장 미생물살충제 효능검정에 관한 연구...99
• 제1절 서론...99
• 제2절 재료 및 방법...100
• 1. 곤충병원성 곰팡이의 배양...100
• 2. 시험곤충의 사육...100
• 3. 실내 생물검정...100
• 4. 온실 실험...102
• 5. 포장 실험...102
• 제3절 결과 및 고찰...103
• 1. 실내 생물검정...103
• 2. 온실 실험...109
• 3. 포장 실험...111
• 제4절 종합고찰...115
• 제5절 적요...116
• 제 4 장 유전공학기법을 이용한 곤충기생균 살충력 향상에 관한 연구...117
• 제1절 서론...117
• 제2절 재료 및 방법...119
• 1. 원형질체 제조...119
• 2. 원형질체의 순수분리 확인...119
• 3. 곤충기생 곰팡이 균주의 형질전환...119
• 가. 일반적인 방법...119
• 나. Electrophoresis 방법...120
• 4. DNA fragment endfilling...120
• 5. Mini preparation of genomic DNA isolation...120
• 6. Chromosomal DNA of fungi...120
• 7. PCR 분석...121
• 8. Western Blot 분석...121
• 9. 살충성 test...121
• 제3절 결과 및 고찰...122
• 1. 곤충기생균의 최적 배양조건 확립...122
• 2. 곤충기생균의 protoplast 제조 방법...122
• 3. Protoplast 확인...124
• 4. 곤충기생균의 각종 항생제 저항성 실험...125
• 5. 곤충기생균으로부터 chromosomal DNA의 분리...128
• 6. 곤충기생균주의 형질전환...128
• 7. 곤충 기생균의 살충력 향상을 위한 새로운 vector의 개발...130
• 8. 형질 전환 곤충기생균에서의 유전자 발현 재조합 plasmid 제조...132
• 9. Electrophoration에 의한 곤충기생균의 형질전환...134
• 10. 곤충기생균주의 chromosomal DNA분리...134
• 11. PCR 분석에 의한 독소 유전자 확인...134
• 12. 독소 유전자의 발현 검증...136
• 13. 형질전환 곤충 기생균주 제재의 독소 발현 분석...137
• 14. 형질전환 곤충기생균 제재의 살충력 시험...138
• 15. Beauveria sp. 균주의 형질 전환...139
• 제4절 종합고찰...142
• 제5절 적요...143
• 제 5 장 곤충기생균 대량배양 기술개발...145
• 제1절 서론...145
• 제2절 재료 및 방법...148
• 1. 사용 균주...148
• 2. 배지...148
• 가. 기본배지 확립...148
• 나. 종균 배양배지 조건 확립...149
• 3. 배양조건 확립...149
• 가. 최적 배양온도의 확립...149
• 나. 최초 초기 pH 측정...149
• 4. 배양방법...150
• 가. 액체배양...150
• 나. 고체배양 및 이단계배양...150
• 5. 기질전처리...150
• 가. Colloidal chitin의 제조...150
• 나. 당밀의 전처리...151
• 다. 볏짚의 전처리...151
• 6. 분석...151
• 가. 당농도의 분석...151
• 나. 효소 역가 측정...151
• 다. 균체량 측정...152
• 라. 액체배양에서 생성된 포자 농도 측정...152
• 마. 고체배양과 이단계배양에서의 포자 농도 측정...152
• 7. 성장 곡선 및 비성장 속도(Specific growth rate) 측정...152
• 8. 다양한 기질에 대한 영향조사...153
• 가. 탄소원의 영향...153
• 나. 무기질소원의 영향...153
• 다. 유기질소원의 영향...154
• 라. 무기염류의 영향...154
• 9. 교반식 반응기에서의 배양...154
• 제3절 결과 및 고찰...156
• 1. 액체배양에서 곤충기생균의 배지 및 배양조건의 확립...156
• 가. Metarhizium anisopliae ARS 978의 대량배양을 위한 배지최적화...156
• 1) 배양온도의 영향...156
• 2) 초기 pH의 영향...156
• 3) 탄소원의 영향...158
• 4) 질소원의 영향...161
• 5) 무기염류의 영향...166
• 나. Metarhizium anisopliae ARS 2231의 대량배양을 위한 배지최적화...169
• 1) 배양온도의 영향...169
• 2) 초기 pH의 영향...169
• 3) 탄소원의 영향...169
• 4) 질소원의 영향...174
• 5) 무기염류의 영향...179
• 다. Beauveria bassiana 726의 대량배양을 위한 배지최적화 및 배양조건의 확립...182
• 1) 볏짚을 기질로 한 경우...182
• (1) 균주의 성장조건 확립...182
• (2) 초기 pH의영향...182
• (3) 종균배양 조건의 확립...182
• (4) 탄소원의 영향...185
• (5) 질소원의 영향...188
• (6) 무기염류의 영향...192
• (7) 교반식 반응기에서 균체 및 포자의 생산...195
• 2) 당밀을 기질로 한 경우...198
• (1) 균주의 성장...198
• (2) 최적 당밀농도의 결정...198
• (3)최적 질소원 및 농도의 결정...198
• (4) 최적배지의 조성...216
• (5) 최적배지에서 삼각플라스크 배양...216
• (6) 교반식 배양기에서 균체 및 포자의 생산...216
• 2. 고체배양 및 이단계배양에서 Beauveria bassiana 726의 배양조건 확립...238
• 가. 고체배양에 의한 활성포자 생산...238
• 1) 삼각플라스크에서 최적화...238
• 2) Bench-scale에서 최적화...238
• 나. 이단계배양에 의한 활성포자 생산...239
• 다. 미생물 살충제 제조...240
• 제4절 종합고찰...244
• 제5절 적요...245
• 제 6 장 참고문헌...247