1. 효모성 진균증의 면역학적 진단용 표준항원 생산연구본 연구는 심부진균증의 면역학적 진단용 표준항원 생산을 위해 효모성 진균감염증의 원인균으로 Candida albicans 와 Cryptococcus neformans 균을 대상으로 연구를 수행하였으며 Candida albicans와 Cryptococcus neformans 국내 임상분리주에서 virulence factor의 동물독성 실험으로 표준항원 생산균주를 선별하고 선별된 균주로부터 심부진균증의 진단용 표준항원을 생산하여 조기진단 가능성을 확인함으로써 심부진균증 진단용 kit
1. 효모성 진균증의 면역학적 진단용 표준항원 생산연구본 연구는 심부진균증의 면역학적 진단용 표준항원 생산을 위해 효모성 진균감염증의 원인균으로 Candida albicans 와 Cryptococcus neformans 균을 대상으로 연구를 수행하였으며 Candida albicans와 Cryptococcus neformans 국내 임상분리주에서 virulence factor의 동물독성 실험으로 표준항원 생산균주를 선별하고 선별된 균주로부터 심부진균증의 진단용 표준항원을 생산하여 조기진단 가능성을 확인함으로써 심부진균증 진단용 kit의 국산화를 위한 기초자료를 제공하고자 하였다. Candida albicans 국내 임상분리주를 수집하여 동정하고 혈청형을 확인한 후 virulence factor 실험과 동물독성실험으로 최종 선별된 Candida albicans KNIH 10 균주를 대상으로 항원인 enolase를 대량 생산하기위해 Candida albicans ENO gene으로부터 primer를 제작하여 PCR을 실시하고 Cloning된 gene을 E. coli system에 발현하여 발현된 enolase를 affinity column을 통해 정제하고 가토 혈청과 반응시켜 항원성을 실험하였다. PCR을 실시한 결과 1.323kb의 생산물을 얻었으며 subcloning 된 생산물을 E.coli system에서 발현시켜 48kDa 분자량의 enolase을 확인하고 가토 혈정과의 immunoblot을 실시한 결과 발현된 48kDa enolaserk 가토 혈청과 반응하는 것을 확인하였다. gene cloning으로 생산한 enolase 항원이특이성을 비교 실험하기위해 Candida albicans 균에서 EPLC을 통해 enolase를 정제하고 환자 혈청과 immunoblot 실험으로 확인하여 gene cloning과 비교한 결과 항원생산 면에서는 gene cloning 방법이 우선하나 항원 특이성에 있어서는 균에서 추출한 enolase를 정제하여 사용하는 것이 특이성이 높았다. 따라서 gene cloning 방법으로 항원 생산도를 높이고 특이성을 높이기 위해서 생산된 항원을 이용한 단클론 항체의 생산과 특이성이 높은 항체의 selection 연구가 지속되어야 할 것으로 본다. 임상에서 분리된 Cryptococcus neformans 균을 대상으로 동정과 혈청형을 조사한 결과 국내에서 혈청형이 A형만이 존재하는 것으로 확인되었다. 또한 항원생산용 균주를 선정하기 위하여 phenol ocxidase 활성도, 협막 형성, melanin 형성 등을 조하하고 2차례에 걸쳐 동물 독성실험을 실시하여 가장 독력이 높은 NHPY24균주를 항원 생산 균주로 선정하였으며 선정된 균주에서 capsule polysaccharide를 추출하고 DEAE column chromatography을 통해 polysaccharide을 분리하였다. 분리된 분획들을 heat killed cell로 면역하여 생성한 가토혈청과 반응시켜 가장 항원력이 뛰어난 성분을 조사한결과 0.2M NaCl 농도구배에서 유출된 항원에서 가토혈청과 반응이 관찰되었다. 또한 항원 추출법으로 많이 쓰이는 CTAB법을 이용한 항원 분리 실험을 병행하여 column을 통한 분리와 비교 실험을 실시하였다. CTAB법을 이용한 분리가 column을 이용하는 분리법보다 가토항혈청과의 반응이 더 강하게 나타났으며 순도에 대한 비교실험이 지속적으로 실시되어야 하며 분리된 항원을 이용한 단클론 항체 생산과 항원의 특이성에 대한 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것이다.2. Aspergillosis와 Mucormycosis의 혈청학적 진단용 표준항원 생산연구우리나라 심부진균증의 원인이 되는 Aspergilosis의 조기 진단을 위한 혈청학적 진단용 표준항원생산을 목표로하여 Aspergillus fumigatus 항원, A, flavus 균주를 수집하여 형태학적인 방법과 분자생물학적인 방법으로 균동정을 하였으며 A. fumigtatus 균동정에 사용된 primer는 marker 1/2이었고, A.favus 균동정에 사용된 primer는 18S-28S 1/2이었다. 여러 병의원으로 부터 진균종(aspergilloma)이 의심스러운 환자의 혈청을 수집하여 명역확산법으로 Aspergillus 상분리주로부터 Aspergilli 의 병원성 인자의 elastase 생산여부를 관찰하여 그 분해능을 측정하였다. 분리된 A. Flavus중에서 균집락 형태가 다르고 elastase 생성능이 좋은 7주를 선택하여 fumigatus ME항원을 제조하여 culture fitrate(CF)항원을 생산하여 비교하였고, 9주의 A. fumigatus ME 항원을 제조하여 DEAE Sepharose fast flow ion exchange chromatography를 통과시켜 A. fumigatus ME, 항원을 정제하였다. A. flavus 항원과 A. fumigatus 항원을 SDS-PAGE로 항원성분을 분리, 생산된 항원의 분자량을 측정하였고 수집된 환자 혈청으로 면학적 검사를. 아울러 Aspergillosis 진단을 위한 기초자료로 환자의 병력, 항체 검출유무, 진단적범주등의 환자치표를 수집하였다. 1,046 건의 임상검체로부터 A. flavus 37주 , A. fumigatus 114주를 수집하여 A. flavus 균주들은 제한효소로 처리하여 RELP 패턴을 비교하여 동정하였으며, A. fumigatus 균주들은 primer 청을 수지하여 A. fumigatus 양성인 환자 혈청 400개와 A. flavus 양성인 화자 혈청 9개를 수집하였다. A.flavus 의 ME 항원과 CF 항원을 비교한 결과, ME 항원이 더 많은 항원성분을 가지고 있었고 환자혈청과 immunoblotting한 결과에서 A. flavus 항원생산을 위한 우량균주로 임상분리균 KIT 1093이, A. fumigatus 항원생산을 위한 우량균주로는 KIT 1006이 선정되었다. 수집된 환자자료를 통해 진균증이 의심되는 환자의 주된 과거 병력은 291명중 191명이 폐결핵이었다.
Abstract▼
This project aim was to select the immunodominant isolate from the clinical isolate of Korea, and produce the immunodominant antigen of selected isolate. We selected antigen producing isolate of Candida ablicans and Crytpcoccus neformans through the virulence factor and mouse toxicity experiment. Us
This project aim was to select the immunodominant isolate from the clinical isolate of Korea, and produce the immunodominant antigen of selected isolate. We selected antigen producing isolate of Candida ablicans and Crytpcoccus neformans through the virulence factor and mouse toxicity experiment. Using the selected isolate, we isolated Candida albicans enolase antigen and Cryptococcus neoformans capsule polysaccharide. We think that isolated immunodominant antigen can be useful tool of the diagnostic method. This research can be the basis of the diagnostic kit improvement. We collected the clinical isolate and identified and serotyped. Through the virulence and mouse toxicity xperiment, selected Candida albicans KNIH 10 isolate as enolase product isolate. Using the Candida albicans ENO gene sequence, we constructed the primer and carried out PCR. After cloning, cloned gene was expressed by th E. coli expression system. Expressed enolase was purified through the affinity column. Purified enolase was reacted with the rabbit antiserum and investigated the antigen antigenicity Candida albicans PCR product size was 1.323kb and expression product had 49kDa M.W. Expressed enolase product immunonlotted with rabbit antiserum. So 49kDa enolae protein showed the positive result. To compare of specificity, we purified enolase of Candida albicans KNIH 10 isolate by the EPLC chromatography. The purified enolse also reacted with patients antiserum. The purified enolase specificity was more high than expressed enolase protein. But expressed enolase production yield was more high than purified enolase. So we think that the research is needed to mark monoclonal antibody using the ivestigated antigen and select the specifi antibody to detect the antigen in patients antiserum. We collected the Cryptococcus neoformans clinical isolate and identified and serotyped. The serotype was A. We selected NHPY24 clinical isolate for antigen product through virulence factor and 1,2nd mouse toxicity experiment. Using the selected C. neoformans isolate, isolated and purified the capsule polysaccharide by DEAE column chromatography. Each column fraction was pooled and reacted with rabbit antiserum to select the antigen activity fraction. Among the fraction, 0.2M NaCl gradient fraction was reacted with antiserum, so pooled the 0.2M NaCl gradient fraction. To compare with antigen production yield and antigenicity, we fractionized the capsule polysaccharide with CTAB into GXM and GalXM antigen fraction. Fractionized capsule polysaccharide with CTAB more strongly reacted with rabbit anitserum than column fraction. We think that more research is needed to the purity and specificity. We investigated the possibility of development of standardized antigens for earldiagnosis to detect Aspergillosis causing of deep mycoses in Korea. Clinical isolates of Aspergillus fumigatus strains and A. flavus strains collected from the patients suspected with fungal diseases for productions of each antigens. Molecular and morphological methods were introduced to identified these isolates using PCR primers marker 1/2 and primer 18S-28S 1/2 used to detect specific DNA for A. fumigatus and A. flavus respectively. Sear were collected from patients with suspected fungai infection, tested with precipitin antibody for Aspergillus antigens by immunodiffusion, evaluated elastase activity from the clinical isolates of A. fumigatus and A. flavus. The antigens made from seven strains of A. flavus which have differect colonial morphology and good elastase activity were compared mycelial extract (ME) antigen with culture filtrate (CF) antigen. One of antigens was applied to an ion exchange chromatography DEAE sepharose fast flow for purification. ME antigens of A. flavus and. A. fumigatus were subjected to SDS-PAGE in 4-12% Bis- Tris gradient polyacrylamide gels and transblotted antigens were probed with the collected patients' sera. Patients information such as clinical history detection of fungi antibody, underlying disease and conditions were also collected for the additional basis of diagnosis of Aspergillosis. Thirty seven strains of A. flavus and 114 strains of A. fumigatus were collected from 1,046 clinical specimens. Sera from 400 patient with positive reaction to A. fumigatus, 9 patient sera positive for A. flavus were collected from 2,006 patients. Speicifi primer marker 1/2 was found to be the most useful primer for the identification of a A, fumigatus and PCR-RFLP with primer 18S-28S 1/2 identified as A. flavus by band patterns. Comparison of the antigens of A. flavus with mucelial extract(ME) and culture filtrate(CF) showed that mycelial extract antigen had many antigen components. Results of immunonoblot finger printing with the collected patient's sera showed that mycelial extract antigen KIT 1093 appeared to be the most useful strain for the antigen production of A. flavus and KIT 1006 for A. fumigatus. One hundred ninety-one out of 291 patients with suspected fungia infection have had the main history of illness, pulmonary tuberculosis.
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